HR-HPV檢測與p16和ki67在宮頸腺上皮病變中的診斷價值

戈文舜，包 磊，魯 波，任麗芳，李美平，楊惠英，蔡紅光

(紹興市婦幼保健院病理科，浙江紹興312000)

近年來，宮頸癌篩查工作的廣泛開展及癌前病變的早發(fā)現(xiàn)、早治療，使宮頸鱗癌發(fā)病率有所下降，但是宮頸腺癌卻逐年上升。由于宮頸浸潤性腺癌(invasive cervical adenocarcinoma，ICA)及前驅病變發(fā)病隱匿、篩查方法局限(液基細胞學不敏感、組織學鏡下形態(tài)多變，個別類型異型性小)以及診斷標準不一等情況，容易造成病變漏、誤診。2014版世界衛(wèi)生組織女性生殖器官腫瘤分類中對宮頸腺癌前驅病變僅保留了原位腺癌(adenocarcinoma in situ，AIS)[1]的概念，即宮頸腺性上皮內病變，含有惡性形態(tài)，若不治療，則有顯著進展為浸潤性腺癌的風險。鏡下往往有重度細胞異型及明顯的核分裂、凋亡。形態(tài)有爭議者，建議行免疫組化p16、ki67檢測，若p16強陽性表達，ki67高增殖指數(shù)，則定義為具有免疫組化特征、形態(tài)學不完整的原位腺癌。同時提出除宮頸胃型黏液性癌及中腎管型腺癌外，其余類型絕大部分與HPV感染密切相關。本研究的目的就是觀察宮頸腺癌及原位腺癌和良性腺上皮病變(benign endocervical glands，BEG)中高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染狀態(tài)和p16、ki67表達情況,探討三項指標與宮頸腺癌及原位腺癌的關系，以提高其診斷檢出率。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2016年1月至2017年12月在紹興市婦幼保健院診斷的宮頸腺上皮病變患者82例，其中原位腺癌18例，浸潤性腺癌23例(普通型腺癌10例，黏液性癌7例，其他類型腺癌6例：絨毛狀腺癌2例、子宮內膜樣腺癌1例、透明細胞癌1例、腺鱗癌1例、低分化腺癌1例)，良性腺上皮病變(宮頸息肉19例、納氏囊腫8例、隧道樣腺叢1例、微腺體增生13例)41例。患者年齡26～81歲，平均年齡45.88歲。同時行HR-HPV分型和免疫組化p16、ki67的檢測。組織學切片由三位高年資病理醫(yī)生復閱全部病理切片，至少兩位醫(yī)師意見一致則確定為最后診斷。診斷標準參照2014年世界衛(wèi)生組織女性生殖系統(tǒng)腫瘤病理學和遺傳學分類標準。

1.2方法

1.2.1 HPV分型檢測

采用羅氏公司生產(chǎn)的cobas 4800 HPV檢測系統(tǒng)，檢測原理是基于PCR反應結合不同熒光染料的探針檢測高危型，可檢出HPV16型、18型及其他12種高危型HPV(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。試劑全部來自羅氏公司生產(chǎn)的配套試劑盒，操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.2.2免疫組織化學染色

標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，2～3μm厚石蠟切片，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片。一抗p16(6H12)試劑、ki67(MIB-1)試劑、Envision試劑盒均購自Dako。免疫組化操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.3免疫組織化學陽性標準

p16：病變細胞核與/或胞漿連續(xù)強陽性表達標記為(+)；細胞核與/或胞漿灶性、斑片狀強弱不等的表達或完全不表達標記為(-)。ki67：陽性信號位于胞核，以陽性細胞百分比數(shù)來體現(xiàn)細胞增殖指數(shù)。以30%為界限區(qū)分良性病變與腫瘤性病變(≤30%；>30%)。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料進行χ2檢驗和χ2分割法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 HR-HPV(16/18)的檢出率

41例ICA及AIS中HR-HPV陽性35例(85.37%)，其中HPV16/18型33例(94.28%)；41例BEG中HR-HPV陽性15例(36.59%)，其中HPV16/18型10例(66.67%)。二者相比，ICA及AIS的HR-HPV，特別是HPV16/18檢出率，顯著高于BEG(χ2值分別為20.50、6.65，均P<0.05)。在ICA與AIS的比較中，單一感染HPV16型為27.27%(3/11)和72.73%(8/11)，與單一感染HPV18型66.67%(10/15)和33.33%(5/15)比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.94，P<0.05)，ICA與AIS中HPV16/18混合感染檢出率(23.53%vs.16.67%)比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.26，P>0.05)，見表1。不同亞型(普通型腺癌、黏液性癌、其他類型腺癌)ICA中HR-HPV檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.53，P>0.05)，見表2。

表1 宮頸腺上皮病變中HPV(16/18)、p16和ki67的表達對比[n(%)]

表2 不同組織學類型的宮頸腺癌中HR-HPV、p16和ki67的表達對比[n(%)]

2.2 p16、ki67的表達及價值

41例ICA及AIS中35例p16陽性表達(85.37%)，36例ki67(+，>30%)(87.80%)；41例BEG中3例p16陽性表達(7.32%)，2例ki67(+，>30%)(4.88%)，ICA及AIS的p16、ki67高表達明顯高于BEG(χ2值分別為50.22、56.69，均P<0.05)，見表1、圖1；但不同亞型ICA中p16、ki6表達比較無明顯差異(χ2值分別為2.53、0.16，均P>0.05)，見表2、圖1、圖2、圖3。單純行p16與聯(lián)合ki67在ICA及AIS中診斷敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為85.37%和94.12%、92.68%和97.37%、92.11%和96.97%、86.36%和94.87%，見表3。

表 3 單獨p16及聯(lián)合ki67檢測在宮頸腺上皮病變中的分布對比[n(%)]

圖1 AIS鏡下示細胞重度異型、基底部凋亡小體及“腔緣”核分裂(HE染色，×100)

Fig.1 Severe cellular atypia, apoptotic bodies in basal surface and mitotic figures in lumenal surface in AIS under microscope (HE staining, x100)

圖2 AIS免疫組化ki67增殖指數(shù)(+，50%)(Envision，×100)

Fig.2 Immunohistochemical ki67 proliferation index in AIS (+，50%) (Envision, x100)

圖3 AIS免疫組化p16呈現(xiàn)細胞核/或漿彌漫強陽性表達(Envision，×100)

Fig.3 AIS showed continuous strong positive expression of p16 in lesion nucleus or cytoplasm (Envision, x100)

2.3宮頸腺上皮病變中HR-HPV(16/18)檢出率與p16的關系

35例呈HR-HPV陽性的ICA及AIS中均顯示p16陽性，6例HR-HPV陰性的ICA病例p16均陰性。35例HR-HPV陽性ICA及AIS中33例HPV16/18及p16陽性(94.29%)，15例HR-HPV陽性BEG中2例HPV16/18及p16陽性(13.33%)，兩者比較有統(tǒng)計學意義(χ2=7.59，P<0.05)。15例HR-HPV陽性的BEG中2例p16陽性(13.33%)，26例HR-HPV陰性的BEG中1例p16陽性(3.85%)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.26，P>0.05)，見表4。

表4宮頸腺上皮病變中HR-HPV與p16的相關性[n(%)]

Table 4 Correlation between HR-HPV and p16 detection in cervical glandular epithelial lesions[n(%)]

3討論

3.1 HPV(16/18)感染在宮頸腺上皮病變中的分布特點

HR-HPV持續(xù)感染，特別是HPV16/18型，在宮頸腺癌的病因學作用已經(jīng)被證實[2]。它可將自身DNA整合到宿主細胞基因組中，其基因產(chǎn)物E6、E7原癌蛋白能引起宿主調節(jié)基因表達失調，從而使細胞不斷增殖，病變程度隨著HR-HPV與宿主染色體整合率的提高而升高。本研究數(shù)據(jù)可以看出ICA及AIS的HR-HPV(特別是HPV16/18)檢出率顯著高于BEG，故其發(fā)生發(fā)展與HPV(16/18型)感染密切相關。同時，提示單一HPV18型感染較HPV16型更多見于ICA，單一HPV16型感染較HPV18型更多見于AIS，而HPV16/18混合感染檢出率兩者比較差異無統(tǒng)計學意義。這與文獻報道[3-5]相似，HPV18型較HPV16型更多見于宮頸腺癌及原位腺癌，而HPV16型與宮頸鱗癌關系最為密切。在HPV16和HPV18雙重感染中，比起任一型別單一感染，并不增加宮頸癌發(fā)生的風險。在活檢或錐切標本中診斷AIS或ICA時，若單一HPV18感染，則需要警惕ICA的可能；而單一HPV16感染的AIS，后續(xù)病變是否仍為AIS或切緣陰性者后續(xù)無殘留病變，還需要進一步加大樣本量深入研究。

3.2 p16與ki67在宮頸浸潤性腺癌及原位腺癌中的診斷價值及與HPV的相關性

p16是一種細胞周期素依賴性激酶抑制物，可通過抑制CDK4/CDK6的活性從而抑制Rb蛋白的磷酸化，進而抑制轉錄因子E2F活性，使細胞分裂停滯于G1期。HR-HPV產(chǎn)生的E7蛋白可與pRb結合，使其失活，釋放E2F，使p16反饋性升高[6-7]。ki67是一種反映細胞增殖活性的免疫標志物。當ki67高表達時提示細胞生長活躍，>30%時往往提示了腫瘤性病變的存在[8-9]。本實驗在ICA及AIS中我們發(fā)現(xiàn)p16呈現(xiàn)細胞核、細胞漿連續(xù)一致的強陽性表達，ki67增殖指數(shù)在30%～90%之間，而在BEG中p16則為灶性斑片狀強弱不等或者完全不表達，ki67一般在5%～30%，且兩者表達具有顯著差異(P<0.05)。p16聯(lián)合ki67在ICA及AIS中診斷敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值均高于單純行p16，同時數(shù)據(jù)提示HR-HPV(16/18)檢出率與p16陽性存在高度一致性，這表明p16、ki67的強陽性高表達不僅在低級別和高級別鱗狀上皮內病變[9-10]中，而且在HPV感染導致的腺上皮良惡性病變鑒別上起著重要的輔助診斷作用。

盡管絕大部分ICA及AIS可以發(fā)現(xiàn)HR-HPV感染及p16、ki67強陽性高表達，但還是存在極少數(shù)與HPV感染不相關且p16陰性的宮頸腺癌[11]，譬如胃型黏液性癌[12-13]、中腎管型腺癌[12,14]、透明細胞癌[12,15]和漿液性癌[12,16]，甚至存在非HPV依賴機制的p16陽性表達。本研究由于病變基數(shù)及特殊類型病例數(shù)較少，導致研究結論有所偏倚。但無論是否HPV感染導致的宮頸腺癌，都需要醫(yī)療機構加強婦科首診醫(yī)師、陰道鏡檢查醫(yī)師和病理診斷醫(yī)師之間的聯(lián)系，定期回顧和總結。對于無癥狀者做好隨訪工作；有異常臨床癥狀(如性交后出血、異常陰道流血或排液、子宮頸表面柱狀上皮外移等)者，必要時可行陰道鏡及宮頸管內膜搔刮術；對于活檢有疑問者，建議借鑒HPV感染型別及行免疫組化p16、ki67輔助診斷。

ICA及AIS的發(fā)生發(fā)展與HR-HPV(16/18)感染密切相關，呈現(xiàn)p16、ki67的強陽性、高表達。HR-HPV(16/18)感染與p16陽性存在高度一致性。單一HPV18型感染多見于ICA，單一HPV16型感染多見于AIS。宮頸活檢或錐切標本為AIS伴單一HPV18感染時，需要警惕ICA的可能。總之，宮頸腺上皮病變的診斷不僅需要掌握組織學鏡下形態(tài)、免疫組化p16和ki67的表達，還需要了解患者HPV感染情況、臨床病史及體征，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，以降低宮頸腺癌的發(fā)病率和死亡率。