鄭延紅， 楊娜娜， 夏作理

(1兵器工業北京北方醫院，北京 100089； 2泰山醫學院生命科學研究所，山東 泰安 271000)

水通道蛋白 4(aquaporin 4，AQP4)在哺乳動物腦內廣泛分布，主要存在于與血腦屏障相關的毛細血管內皮細胞及其相連的膠質細胞，其次是腦室室管膜上皮細胞、腦室脈絡叢上皮細胞和下丘腦神經元[1]，腦干神經核團和大腦皮質部分神經元也有分布，其表達遠比AQP1和AQP9表達豐富，并且其高度快速轉運水的能力比其它的水通道蛋白對水的通透性高3～4倍，在腦內擔負著水代謝平衡的調節和神經興奮性的保持作用[2]。AQP4不僅參與了細菌性腦膜炎和腦缺血早期、腦出血及腦創傷后等的細胞毒性腦水腫的形成[3]，而且加快腦腫瘤、腦出血、創傷等形成的血管性腦水腫的消散[4]。然而，在淋巴性腦水腫(lymphatic brain edema，LBE)形成和消散機制中，AQP4的地位尚不明確。為此，本實驗目的旨在研究LBE腦含水量與AQP4表達的關系，以明確AQP4在LBE中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

選用健康、雄性Sprague-Dawley大鼠(山東大學動物實驗中心提供)，體質量(246±44)g，平均268 g，隨機分為假手術組(sham組)和淋巴性腦水腫組(LBE組)。各取90只大鼠分別制作LBE動物模型和假手術，每組于相應手術后第1、3、7、11及15天取大腦皮質，分別進行腦含水量、AQP4免疫熒光組織化學及免疫印跡蛋白表達的檢測。

2 動物模型及標本的制備

2.1動物模型的制備 按照改良的Casley-Smith方法[5]，以鹽酸氯胺酮50 mg/kg和地西泮5 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。固定后，頸部手術區剪毛，常規消毒、切開皮膚，分離皮膚及皮下組織，分別暴露雙側頸淺、頸深淋巴結及相應淋巴管，結扎淋巴管并摘除淋巴結，然后逐層縫合。模型成功的判斷標準：術后出現明顯的行為改變，頸部切口無滲出、腫脹及感染，顯微鏡下有典型的腦水腫征象為模型制作成功。假手術組步驟同模型組，但不結扎淋巴管，亦不摘除相應的淋巴結。

2.2標本的制備 每個時點各取6只大鼠，深麻醉大鼠，0.1 mol/L PBS (pH 7.4) 經心灌注，然后斷頭處死，冷環境條件下迅速取腦，分取右側大腦皮層組織120 mg左右稱重，進行腦含水量測定。左側大腦皮層組織留取標本，進行免疫印跡蛋白表達的檢測。另各取3只大鼠，先用37 ℃肝素化生理鹽水(含肝素5 000 IU)100 mL沖凈血液，然后緩慢灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(4 ℃ pH 7.4)300～400 mL，開顱取大腦皮層組織，后固定24 h。放入20%、30%蔗糖梯度脫水，待腦組織下沉后，-20 ℃ 低溫冠狀面冰凍切片備用。每10張取2張，片厚6 μm，取2套切片，1套行AQP4免疫熒光組織化學染色，另1套作為陰性對照。

3 主要方法

3.1腦含水量測定 按干-濕重法測定大腦皮層組織含水量：將取出的大腦皮層組織標本，迅速稱濕重，然后放置于高溫干燥箱內，105 ℃，干燥48 h后，稱量得到干重。腦組織腦含水量按Elliott公式計算：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.2免疫熒光組織化學染色法 切片放入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)漂洗3次，每次5 min。漂洗后放入10%羊血清中，37℃孵育1 h。將切片放入稀釋后的兔抗大鼠AQP4Ⅰ抗(1∶100，Santa Cruz)中，移入4 ℃冰箱孵育過夜。PBS漂洗3次，每次5 min，切片滴加熒光素FITC標記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶100，Santa Cruz)，37℃孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min。封片，應用Radiance 2100 型熒光掃描共聚焦顯微鏡觀察，Image-Pro Plus圖像分析系統分析熒光強度值。每個標本染3張切片，每張隨機取5個視野(×400倍)的圖像。陰性對照不加AQP4Ⅰ抗，代之以PBS。結果判定：AQP4陽性表達為胞膜及胞漿內出現綠色熒光信號。隨機選取5個視野的圖像，應用Image-Pro Plus軟件計數熒光陽性表達數，并計算每只大鼠的平均熒光強度。

3.3Western blotting 按照RIPA試劑盒快速提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，10% Tris-glycine SDS-PAGE，濕轉將蛋白條帶轉移至 PVDF膜上，Western blotting 封閉液室溫封閉1 h; 加兔抗大鼠AQP4(1∶1 000，Santa Cruz)，4 ℃過夜；加堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG(1∶2 500，Sigma)，室溫孵育2 h，BCIP/NBT顯色，使用Quantity One 軟件進行半定量分析，結果以目的蛋白和β-actin 吸光度的比值表示。

4 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示。多組樣本均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 腦含水量的變化

在LBE組，大鼠大腦皮質含水量呈先增加后降低的趨勢，術后第3天開始上升(P<0.05)，第7天達到峰值(P<0.01)，第15天仍高于假手術組水平(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Changes of the cerebral cortex water content in rats with LBE. Mean±SD.n=6. *P<0.05,**P<0.01 vs sham.

2 AQP4免疫熒光組織化學表達的變化

Sham組大鼠的大腦皮質可見AQP4免疫熒光染色陽性神經膠質細胞足突及血管周圍少量分布，LBE后3 d即見陽性細胞數目增多，免疫熒光染色強度增高(P<0.05)，至7 d陽性細胞數目最多，且染色強度最高(P<0.01)，以后逐漸減少，15 d未恢復至正常，見圖2。

Figure 2. Laser confocal microscopy of AQP4-immunofluorescence,intensity and cell number in cerebral cortex of rats with LBE. Scale bar=50 μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs sham.

3 AQP4蛋白表達的變化

Sham組大鼠的大腦皮質可見AQP4蛋白微弱表達，LBE后3 d AQP4表達增加(P<0.05)，7 d達到峰值(P<0.01)，15 d仍高于假手術組水平(P<0.05)，見圖3。

4 淋巴性腦水腫大腦皮質含水量與AQP4蛋白表達的相關性

大腦皮質含水量和AQP4蛋白表達均呈正相關關系(r=0.8024，P<0.05)。

討 論

腦水腫是指腦組織含水量增加引起腦容積的擴張，為中樞神經系統對各種原因的腦損害產生的一種組織病理反應，是各種腦部疾病的嚴重并發癥。

Figure 3. Changes of AQP4 expression in cerebral cortex in rats with LBE (Western blotting). Mean±SD. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs sham.

按其發生機制又分為細胞毒性水腫和血管源性水腫[6]，主要與細胞膜能量代謝障礙、腦微循環障礙及血腦屏障(blood brain barrier，BBB)、自由基、鈣超載、興奮性氨基酸的毒性作用、一氧化氮、內皮素等因素有關[7]，但確切機制尚不明確。近年來隨著分子的研究深入，AQP4日益成為腦水腫研究的熱點。AQP4 主要存在于腦星形膠質細胞、毛細血管內皮細胞、室管膜上皮細胞、鄰近軟腦膜的膠質細胞及脈絡叢上皮細胞中，覆蓋超過95%的腦毛細血管表面[8]，并且AQP4 在大腦的大量分布，以及在星形膠質細胞上的分布呈明顯的極性，即在靠近血管內皮細胞的星形膠質細胞終足上大量表達[9]，因而成為膠質細胞與腦脊液及血管之間水轉運和調節的重要結構基礎，在維持腦內水平衡中發揮重要作用。

組織病理及超微結構觀察顯示[10],LBE時腦組織明顯水腫，并有紅細胞溢出以及吞噬細胞浸潤，腦的小動脈外膜出現半月形或不規則形間隙，其間充滿水腫液，形成腦間質水腫，為血管源性水腫。同時，水腫區腦組織出現慢性進行性缺血、缺氧及酸中毒等病理過程，進而使細胞間正常的物質及信號傳遞障礙，細胞代射紊亂，神經細胞膜ATP合成減少，鈉鉀泵失調使細胞內高滲，細胞內外的滲透壓變化可能通過上調AQP4 表達加速水分流入，形成細胞毒性腦水腫[11]。最終形成血管源性水腫和細胞毒性水腫并存的混合性水腫，許多情況下難于明確區分。

本實驗中，與sham組相比，LBE模型大鼠大腦皮質AQP4免疫熒光及蛋白的表達水平明顯增加，均以術后7 d水平最高，后逐漸降低，15 d時仍高于sham組，腦含水量的變化趨勢與之相一致，且腦含水量與AQP4蛋白表達呈正相關關系，提示AQP4參與腦水腫時腦組織水分布的變化，同時AQP4介導的跨細胞膜水的轉移為血管性腦水腫液體清除的關鍵[12]。LBE時乳酸中毒、鈉鉀泵和鈣失衡以及滲透壓變化為細胞性水腫的主要原因[13]，AQP4為水跨星形膠質細胞運輸的主要路經，通過AQP4參與水大量而快速通過細胞膜，導致星形膠質細胞和神經元腫脹[9]和BBB的破壞。我們推斷，缺血缺氧能夠誘導星形膠質細胞AQP4蛋白活性部分得到激活，水大量而快速通過細胞膜，以降低細胞內外的滲透壓梯度，使滲透性物質進一步流入膠質細胞，導致細胞體積的增大，AQP4在促進水分進入星形膠質細胞中起著重要作用[14]，因此早期AQP4表達增高是膠質細胞的適應性反應。血管源性腦水腫的水腫液清除主要通過細胞外間隙和膠質細胞界膜至腦室和蛛網膜下腔，另外還通過膠質細胞終足和毛細血管內皮細胞入血[15]，而AQP4正是在大腦這些區域大量表達，AQP4 的開放和表達升高有利于加速水腫的消退，可在一定程度減輕血管源性腦水腫。由于LBE為細胞性和血管源性水腫共同存在，因此AQP4的表達升高，不僅參與了腦水腫的形成，也有助于LBE的吸收與恢復。

我們推測，LBE后出現能量代謝障礙，初期細胞缺氧引起細胞毒性水腫，隨之而來的是血管源性水腫，并且在7 d達到高峰，以后逐漸減輕。細胞毒性水腫階段AQP4逐漸升高，說明腦水腫越重，神經元的破壞越明顯，血管性水腫時AQP4顯著表達，以加快腦水腫的清除。AQP4在星形膠質細胞介導水的運輸，跨過BBB交界面對水分子的流向起著雙向調節作用[1]，因此AQP4在LBE后腦水腫的形成和消除中發揮了重要的作用。

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