Citrin缺陷導致的新生兒肝內膽汁淤積癥患兒SLC25A13基因突變與生化指標的相關性研究*

盧春婷， 李佳縈， 馮 烈△， 宋元宗， 張占會， 盧筱華， 陳纖纖

(暨南大學附屬第一醫院 1內分泌代謝科， 2兒科， 3中心實驗室， 廣東 廣州 510632)

在全球范圍內，嬰兒膽汁淤積性黃疸的患病率約為1/2 500[1]。其最常見的病因為膽道閉鎖、感染和遺傳性代謝異常如citrin缺陷病 (citrin deficiency, CD)、半乳糖血癥、糖原累積病等[2]。沒有明確病因的嬰兒膽汁淤積性黃疸被稱為特發性新生兒膽汁淤積癥(idiopathic neonatal cholestasis, INC)。CD是由編碼citrin蛋白的SLC25A13基因突變所致的一種常染色體隱性遺傳病[3]，目前已在CD患者中發現81種SLC25A13致病突變類型[4-5]。CD有3種年齡相關的臨床表型，分別為citrin缺陷導致的新生兒肝內膽汁淤積癥(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency, NICCD)[6]、成人發病瓜氨酸血癥II型(adult-onset citrullinemia type Ⅱ, CTLN2)[3,7]以及citrin缺陷導致的生長發育落后和血脂異常(failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency, FTTDCD)[4]。作為CD的主要兒科臨床表型，NICCD在我國并不罕見。分子流行病學調查顯示我國人群SLC25A13突變攜帶率為1/63，其中江南地區高達1/48[8]。NICCD主要在新生兒或嬰兒期發病，以肝大、黃疸、肝功能異常和低血糖為主要臨床表現[7]。本研究旨在分析NICCD患兒血糖等生化指標及SLC25A13基因突變特點，并探討兩者相關性。

材 料 和 方 法

1 對象

2013年3月1日至2013年10月31日在我院以膽汁淤積性肝病臨床表現就診的0～12月齡嬰兒。經SLC25A13基因分析確診的NICCD患兒為病例組 (NICCD組)；經基因分析排除NICCD診斷且未發現明確病因的INC患兒為對照組 (INC組)。本研究進行SLC25A13基因突變分析獲得患兒父母書面知情同意。

2 方法

2.1DNA提取及SLC25A13基因診斷 采用DNA抽提試劑盒(Simgen)提取所有研究對象的外周血DNA；DNA marker、普通Tag酶及LA-Taq均購自TaKaRa；引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。PCR反應(PTC-200，Life Science Inc.)及凝膠電泳條件(PAC300，Bio-Rad)參考文獻[9-10]。對研究對象進行4種SLC25A13基因高頻突變的篩查[4]，若只發現一個突變等位基因則進一步對SLC25A13基因的所有18個外顯子及其側翼序列進行測序。測序反應基于Sanger的雙脫氧終止法原理，以PCR引物作為測序引物(BigDye Terminator試劑盒, BI3730測序儀)。由英濰捷基(上海)貿易有限公司廣州分部完成測序反應。

2.2生化指標檢測 所有患兒空腹抽取靜脈血，生化實驗室檢查在Hitachi 7600儀器上完成，檢測所有研究對象的血糖和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)，肝酶指標丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-glutamyltransferase, GGT)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)，血脂指標甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)等數據資料。

3 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，AFP及肝酶指標采用中位數 (最小值～最大值) [median (minimum～maximum)]表示。對計量資料采用t檢驗、方差分析或Wilcoxon秩和檢驗進行分析，對計數資料采用2檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 NICCD血糖及其它生化指標的特點

NICCD組患兒36例，其中男14例，女22例，年齡1～12月。INC組患兒23例，其中男16例，女7例，年齡0.5～12月。如表1所示，分別經Wilcoxon秩和檢驗及t檢驗，兩組間的ALT及LDL-C差異顯著 (P<0.05)。NICCD組血清ALT及LDL-C的中位數均較INC組低，見圖1。NICCD組血糖均值較INC組低[(5.0±1.2) mmol/Lvs(5.1±1.0) mmol/L]，但差異無統計學意義。

表1 NICCD組與INC組患兒的實驗室指標比較

Figure 1. The serum levels of ALT (A) and LDL-C (B) in the patients with NICCD and INC. ○ and ☆ represent the outlier and extreme value, respectively.NICCD: neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency; INC: idiopathic neonatal cholestasis; ALT: alanine aminotransferase; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol. P<0.05 betweem the 2 groups.

2 SLC25A13基因突變類型在不同性別及年齡段患兒之間的差異

本研究36例NICCD患兒共檢出SLC25A13基因突變10種， 其中851del4、IVS16ins3kb、IVS6+5G>A和1638ins23為高頻突變，分別占全部突變的61%、11%、6%及4%，總和占82%；其余6種分別為IVSins6kb、R360X、C.2T>C、C.415G>A、Q259X和IVS11+1G>A，均為文獻已報道的突變。另有5個等位基因的突變性質有待明確。經2檢驗，不同性別NICCD患者的SLC25A13基因突變類型分布無不同 (2=2.27，P>0.05)；將NICCD患兒按月齡段分為4組，經2檢驗，不同年齡段的NICCD患兒SLC25A13基因突變類型無不同(2=12.03，P>0.05)。

3 SLC25A13基因突變類型與生化指標的關聯性

討 論

Citrin由SLC25A13基因編碼，是一種存在于線粒體內膜的天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白，主要在肝臟表達。Citrin的主要功能是將線粒體內天冬氨酸轉運至胞質，提供尿素、蛋白及核苷酸的合成原料；同時，將胞質的谷氨酸轉運至線粒體內部。以上過程與蘋果酸穿梭相耦聯，伴隨著胞質中的NADH氧化為NAD+，從而維持NADH/NAD+比值的恒定，保持了胞質中氧化還原狀態的穩定性。此外，citrin還參與能量、氨基酸、脂類代謝，并在糖酵解、糖異生代謝途徑中發揮重要作用。NICCD是嬰幼兒膽汁淤積癥的常見病因，而citrin缺陷所致的生化與代謝異常的具體機制目前尚未十分清楚[11]。

已有研究指出NICCD與低血糖的發生有關，有學者認為這可能與citrin缺陷導致蘋果酸穿梭障礙，導致胞內NADH/NAD+比值升高，抑制NADH的氧化磷酸化，致使糖酵解及糖異生受阻有關[12]。在本研究中，NICCD患兒的血糖均值較INC組低，但差異無統計學意義，與國內有關研究結果不一致[13]。這可能與本研究的對照組為非健康人群，亦可能是由于NICCD組患兒樣本例數較少所致。有研究顯示，與INC患兒相比，NICCD患兒的血清ALT水平較低[5]，本研究結果與此一致。本研究發現NICCD患兒LDL-C水平低于INC組，在國內外屬首次報道。LDL-C是富含膽固醇的脂蛋白，主要由肝臟合成，其主要作用是把膽固醇從肝臟運送到全身。NICCD患兒LDL-C的水平低于INC組，考慮是2種疾病的病因與發病機制不同所致。低LDL-C血癥可能為NICCD患兒血脂紊亂的特點。

表2 SLC25A13基因突變類型與生化指標關聯性分析

本研究NICCD患兒中共檢出SLC25A13基因突變10種，其中851del4、IVS16ins3kb、IVS6+5G>A及1638ins23突變占所有突變的82%，為高頻突變。其中，851del4所占比例為61%，是最常見的突變類型。該突變在我國SLC25A13突變攜帶者中占70%[14]；而在患有膽汁淤積性黃疸癥的嬰兒中，該突變攜帶率為1/17，遠遠高于此突變在健康人群中的攜帶率(1/93)[15]。SLC25A13突變與血糖、ALT、AST、ALP、TG、 HDL-C及LDL-C無關聯，其原因可能為不同的SLCA25A13基因突變對 citrin 蛋白功能造成的影響程度并無不同，下一步需從蛋白水平證實以上假設。另外，NICCD 患者基因型與生化表型的關系，可能存在其它影響因素，如某些未知的修飾基因、飲食因素，或者某種藥物的治療效果等。本研究提示SLC25A13基因突變分布與GGT的水平有關聯，但該發現的意義或價值尚不明確。是否攜帶某種SLC25A13突變基因的患兒其GTT水平較攜帶其它突變的患兒高，有待采取增大樣本量的方式進行深入研究。

[參 考 文 獻]

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