IL-33基因單核苷酸多態性與中國南方漢人炎癥性腸病臨床表型相關*

張青森， 楊慶帆， 陳白莉， 何 瑤， 陳旻湖， 曾志榮

(中山大學附屬第一醫院消化內科, 廣東 廣州 510080)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因尚不清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn disease，CD)。近年來，炎癥性腸病的發病率明顯上升[1-2]。然而，其發病機制仍未明確，目前認為是由遺傳、環境和免疫等多因素共同作用所致。

白細胞介素33(interleukin-33，IL-33)是新近發現的炎癥因子，具有抑制和促進炎癥的雙重作用[3-4]，與多種免疫及過敏性疾病相關[5-6]。研究發現，其在IBD患者腸、黏膜和血清中明顯異常表達[7-8]，并在IBD炎癥、黏膜愈合及纖維化等方面發揮重要作用[9]。Latiano等[10]近期發現IL-33基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP) rs3939286增加意大利人IBD發病風險，而關于IL-33基因多態性與中國人群IBD的關系尚無報道，本研究旨在探討IL-33基因單核苷酸多態性與中國南方人群IBD發病及臨床表型間關系。

材 料 和 方 法

1 研究對象

將我院 2003年～2012年IBD診治中心確診的365例IBD患者 (CD 250例，UC 115例)，以及同期在我院健康體檢的622名性別、年齡匹配的健康人(無免疫系統相關病史)納入本研究。IBD診斷標準參考2012年中華醫學會消化病學分會推薦標準[11]，基于臨床表現、消化內鏡及組織學檢查作出臨床診斷，確診病例為經病情觀察符合CD/UC病程經過或通過手術取得病理診斷者。臨床資料通過查閱我中心IBD數據庫獲得，包括患者人口學資料及臨床分型特征，即性別、發病年齡、癥狀、吸煙史、家族史、腸外表現、肛周病變、臨床特征等，IBD臨床分型采用蒙特利爾分型標準[12]，見表1。本研究已通過中山大學附屬第一醫院臨床研究倫理委員會批準，標本采集獲得研究對象的知情同意。

表1 炎癥性腸病病人基本資料

2 方法

2.1基因組DNA獲取 采集患者及健康對照每人2 mL外周血，利用天根血液基因組織DNA 提取試劑盒 (北京天根有限公司) 提取基因組DNA。操作步驟參見試劑盒說明書。

2.2SNP挑選及分型檢測 本研究選擇的8個標簽SNP(Tag-SNP)是綜合考慮已有文獻對于IL-33與疾病關系的報道以及SNP位點在IL-33基因的具體位置而確定的，前者基于IBD與多種免疫相關疾病存在基因重疊，后者基于突變點是否可能影響IL-33的表達及功能(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?chooseRs=doublehit&locusId=90865&mrna=NM_001199640.1&ctg=NT_008413.18&prot=NP_001186569.1&orien=forward&refresh=refresh)。各位點的功能特性、最小等位基因頻率及與疾病的關系情況見表2。SNP檢測采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF MS)，由深圳華大基因有限公司完成。

表2 8個SNP的基本信息

2.3相關評判標準 內鏡下黏膜愈合情況依據CDEIS評分分為愈合、部分愈合和未愈合3個等級；愈合定義為CDEIS評分<3分和(或)內鏡下未見潰瘍；部分愈合定義為CDEIS評分3～6分和(或)內鏡下腸道黏膜輕度炎癥、小糜爛、淺潰瘍或者潰瘍較前好轉；無效定義為CDEIS評分較前下降<5分，潰瘍仍然存在，較前無明顯消失或者變淺[11,13]。英夫利昔單抗臨床療效評估依據CDAI[11]，臨床有效定義為CDAI下降≥70分，臨床緩解定義為CDAI下降雖<70分但CDAI<150分，臨床無效為使用英夫利昔單抗治療10周時患者臨床癥狀未改善且CDAI評分>150分。

3 統計學處理

應用SPSS 13.0統計軟件分析。根據Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，采用2檢驗分析CD、UC及對照組樣本的群體代表性。各SNP位點在病例組與對照組基因型及等位基因分布頻率的比較采用 Pearson2檢驗；基因型及等位基因與IBD臨床特征間關系采用單因素和Logistic回歸分析，計算優勢比(odds ratio，OR)及其95%置信區間(confidence interval，CI)，其中OR值經性別和年齡校正。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 一般情況

本研究病例組共納入365例IBD患者，均為中國南方漢族人(表1)，其中CD 250例，UC 115例。CD患者平均年齡(32.7±12.3)歲，其中男性160(64.0%)例；UC患者平均年齡(38.0±13.6)歲，男性共68(87.0%)例。對照組共622名，平均年齡(31.4±8.0)歲，男性400(64.3%)例。CD及UC組與對照組間的性別和年齡構成比均無顯著差異(P>0.05)。

2 IL-33各SNPs基因型在IBD患者及健康人群中的分布

挑選的8個SNP在CD、UC及對照組中基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。進一步分析比較發現，這8個SNP位點的基因型及等位基因頻率在病例及對照組中均無顯著差異(P>0.05),見表3。

表3 各SNP的基因型在CD、UC及對照組中頻數及頻率分布情況

3 IL-33各SNPs基因型與IBD臨床表型的關系

rs10118795和rs7025417的基因型與CD患者腸外表現相關。rs10118795 含等位基因T的基因型(包括CT和TT)是腸外表現的保護因素(P<0.05, OR=0.513, 95% CI： 0.281～0.938)，見表4；而rs7025417 CC基因型的CD患者出現腸外表現的風險更高(P<0.05, OR=1.363, 95% CI： 1.006～1.846),見表5。

表4 rs10118795基因型與CD臨床特征的相關性

表5 rs7025417基因型與CD臨床特征的相關性

rs10118795及 rs10975519與CD患者肛周病變相關，而rs10975509跟CD患者初診時病變部位相關。rs10118795 含C等位基因的基因型(CC和CT)降低肛周病變風險(P<0.05, OR=0.480, 95% CI： 0.232～0.994),見表4；而rs10975519野生純和子CC顯著增加肛周病變風險(P<0.05, OR=2.054，95% CI： 1.053～4.009),見表6。對于rs10975509，其與上消化道型CD高度相關，含G等位基因的基因型(GA和GG)增加上消化道型CD風險(P<0.05, OR=3.570, 95% CI： 1.328～9.600)，同時該SNP 的A等位基因是回結腸型CD(P<0.05, OR=0.613, 95% CI： 0.377～0.996)的保護因素,見表7。

表6 rs10975519基因型與CD臨床特征的相關性

表7 rs10975509基因型與CD臨床特征的相關性

在SNP與英夫利昔單抗治療療效關系分析中，共納入29名長期行英夫利昔單抗治療CD患者，我們分析了8個SNP位點基因型與10周、30周內鏡黏膜愈合情況及臨床療效的關系。rs10118795、rs10975509和rs7025417基因型與英夫利昔單抗治療后CD患者30周黏膜愈合相關(分別為P<0.05、P<0.01和P<0.05),見表8，但進一步分析未能明確某一個基因是30周黏膜愈合的危險或者保護因素。8個SNP與英夫利昔單抗治療臨床療效無關。

表8 SNP與CD患者英夫利昔單抗治療30周黏膜愈合情況的相關性

同時，對這8個SNPs與UC發病及臨床表型的關系的分析未發現相關性(P>0.05)。

討 論

IBD作為一種發病率逐年增加的腸道非特異性炎癥性疾病，其發病機制目前尚不清楚，研究表明遺傳、免疫、環境等多種因素參與到IBD發病中。在遺傳方面， IBD國際基因協作組通過GWAs及基因芯片技術已經發現有關IBD的163個基因位點[14]，盡管如此，仍有約30%常見變異型未被包括在內。許多研究顯示，炎癥因子及其受體基因的SNP與IBD疾病易感性相關，例如很多IL-1家族成員，如IL-1β[15]、IL-1RA[16]、IL-18等[17]，它們的基因SNPs均與IBD疾病易感性相關。IL-33是IL-1家族的新成員。研究發現，其對炎癥具有雙向調節作用：一方面，可進入核內抑制基因轉錄[3]，最終抑制炎癥信號通路；另一方面，可通過與跨膜ST2(ST2L，需IL-1RAcP輔助)[4]作用激活炎癥通路，從而促進腸道炎癥；此外，IL-33還可促進IBD炎癥慢性轉化并參與腸黏膜愈合、上皮修復及纖維化過程[18]。

本研究選擇了IL-33基因的8個SNP位點，研究其與中國南方漢人IBD間的關系。數據分析結果顯示，這8個SNP位點并不增加IBD發病風險，但我們發現rs10118795、rs7025417、rs10975509和rs10975519影響CD的臨床表型。

rs10118795、rs7025417和rs10975509均位于轉錄因子結合位點(transcription factor binding site，TFBS)，TFBS是與轉錄因子結合的DNA序列，它們與轉錄因子相互作用調控基因的轉錄過程，因此這些位點的變異可能影響IL-33的表達，從而影響疾病表型。我們研究首次發現這3個SNP位點與CD相關。rs10118795 T等位基因是腸外表現的保護因素，且C等位基因攜帶者出現肛周病變的風險降低；而在rs7025417，攜帶基因型CC的CD患者出現腸外表現的風險更高；rs10975509則與CD病變部位相關，AA基因型的患者出現上消化道型CD風險更高，同時數據顯示該SNP GG基因型增加出現回結腸型CD的風險。最后，我們還發現這3個SNP的基因型與英夫利昔單抗治療后CD患者30周黏膜愈合相關，但進一步分析未發現哪一個基因是30周黏膜愈合的危險或者保護因素，可能是樣本量不足所致。

rs10975519和rs1929992在日本人花粉癥中有報道[19]，前者與花粉癥發病無關，而后者CC型基因增加該病發病風險。本研究并未發現rs1929992與中國IBD發病及臨床表型相關，但rs10975519 CC型增加CD患者出現肛周病變機會，據報道[19]rs10975519位于IL-33基因外顯子區域，可出現錯意突變，并與周圍堿基形成剪切增強子或剪切沉默子，由此可能影響IL-33的表達水平或者mRNA穩定性。

rs11792633和rs7044343均為內含子，前者與漢人及白種人阿爾茲海默病發病相關，其T等位基因為該疾病的保護性因素，而后者只與白種人阿爾茲海默病發病相關[20]，但本研究未發現它們在IBD中的作用。

由于這8個SNP位點存在高度連鎖不平衡，所以未進一步做單體型分析。另外，本研究中納入進行IL-33 SNP與英夫利昔單抗治療療效關系分析的樣本數目過少，因此，它們之間的具體關系有待繼續論證。

IBD的遺傳背景十分復雜，作為一種多基因疾病，不同的人種、國家甚至地區間均存在遺傳易感性差異，本研究分析了IL-33與中國南方漢人IBD遺傳易感性的相關性，發現了與中國南方人群相關的tSNPs，其中rs7025417跟CD臨床表型相關，然而Latiano等[10]研究表明，rs7025417跟意大利IBD的發病及臨床表型均無關，這進一步說明不同種族存在著遺傳易感性差異；此外，IL-33與其他人群的關系有待進一步研究，以便全面認識IL-33與IBD的關系。IL-33基因多態性與其表達是否相關，其多態性參與調節IBD疾病進展的具體機制仍有待研究。

[參 考 文 獻]

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