Tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞在不同程度人牙周炎組織中的量化研究*

李 娟， 尹小萍， 藍 田， 呂芳麗， 黃 博， 陳 柯， 黃世光△

(1暨南大學醫學院口腔醫學系, 廣東 廣州 510632； 2中山大學醫學院寄生蟲教研室，廣東 廣州 510080；3廣州市婦女兒童醫療中心口腔科，廣東 廣州 510623)

T細胞免疫球蛋白黏蛋白1(T-cell immunoglobulin mucin 1，TIM-1)作為一種免疫調節分子，并能影響肥大細胞的功能[1]。我們前期的研究顯示肥大細胞的募集和脫顆粒、肥大細胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)與牙周炎的嚴重程度相關，提示肥大細胞在牙周炎的發病及病理過程中起重要作用[2-4]。研究顯示TIM-1可能發揮雙向的免疫調節作用[5]。目前類胰蛋白酶(tryptase)和TIM-1雙陽性肥大細胞與牙周炎的關系未見報道。本文通過免疫熒光雙染色方法觀察分析不同病變程度牙周炎牙齦組織中tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞的表達，探討tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞在牙周炎發病中的作用。

材 料 和 方 法

1 研究對象

1.1牙周炎病例選擇 選擇2010年1月～2013年1月在暨南大學荔灣口腔教學醫院牙周科就診的25～65歲成年人共92例，其中男性47例[(46±13)歲],女性45例[(42±14)歲]，所有患者均無糖尿病和其它系統疾病；納入標準依據美國牙周病學會1999年的牙周病新分類指南[6]；所有受試者均在取材前1周先行齦上和齦下刮治術，并簽署知情同意書。

1.2分組及取材 (1)正常對照組27例，取自因正畸治療需要拔除的牙周健康的前磨牙：牙齦無炎癥、無牙周袋、無附著喪失、X線片顯示無牙槽骨吸收； (2)輕度牙周炎組34例，為需要接受臨床牙冠延長術的慢性牙周炎患者：牙齦有炎癥、探診出血、牙周袋≤4 mm、附著喪失≤2 mm、X線片顯示牙槽骨吸收不超過根長的1/3；(3)重度牙周炎組31例，取自無保留價值或預后極差需要拔除的重度牙周炎患者：牙周袋>6 mm、附著喪失≥5 mm、X線片顯示牙槽骨超過根長的1/2、甚至達根長的2/3、多根牙有根分叉病變、牙齒多有松動、炎癥明顯或可發生牙周膿腫。本研究未收集到中度牙周炎的牙齦標本。

2 方法

2.1組織標本采集、處理與觀察 牙齦標本于4%中性甲醛液中固定48 h以上，制成頰舌向5 μm厚度連續切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察牙齦組織學改變。由2名病理醫師盲法觀察，并對牙齦組織的炎癥細胞浸潤情況進行評分，求其平均值。炎癥程度評分標準參照Huang等[7]的方法：0：無炎癥細胞浸潤；1：輕度炎癥，炎癥細胞局部呈小灶狀浸潤；2：中度炎癥，炎癥細胞呈灶狀及片狀浸潤；3：重度炎癥，炎癥細胞在牙齦組織內呈彌漫性浸潤。

2.2Tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞免疫熒光雙染色法 免疫熒光雙染色：Ⅰ抗tryptase抗體(Abcam，稀釋濃度為1∶200)和TIM-1抗體(武漢博士德，稀釋濃度為1∶100)；Ⅱ抗山羊抗鼠IgG(H+L)Alex Flour? 488(Cell Signaling Technology)和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour?555(Cell Signaling Technology)，稀釋濃度為1∶200。牙齦切片經過檸檬酸液修復、Ⅱ抗血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色后，立即在熒光顯微鏡下觀察。免疫熒光陽性信號tryptase表達為綠色熒光，TIM-1表達為紅色熒光，定位于細胞膜或細胞漿，同一視野tryptase與TIM-1重疊后為橘黃色熒光。染色切片由2名病理醫師于熒光顯微鏡下觀察tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞，并計數，通過測量切片組織的面積，獲得每平方毫米的細胞個數(cells/mm2)，取其平均值。

3 統計學處理

數據以均數±標準差 (mean±SD) 表示，采用SPSS 13.0統計學軟件分析。不同組間的牙齦組織病理學觀察數據使用多個獨立樣本比較的Kruska-Wallis檢驗分析，多組間每平方毫米tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞數的比較采用多個獨立樣本兩兩比較的Nemenyi檢驗。以P<0. 05為差異有統計學意義。

結 果

1 組織學觀察

正常對照組，未見明顯炎癥細胞浸潤(圖1A1、A2)；輕度牙周炎組，可見少量散在炎癥細胞浸潤(圖1B1、B2)；重度牙周炎組，出現明顯的炎癥細胞浸潤，并見淋巴細胞和漿細胞(圖1C1、C2)。各組牙齦組織炎癥程度評分見圖2，結果顯示，與正常對照組相比較，輕度和重度牙周炎組的炎癥程度評分顯著升高(P<0.05)；重度牙周炎組的炎癥程度評分明顯高于輕度牙周炎組(P<0.05)。

Figure 2. Scoring of inflammation in gingival tissues. A: healthy control group (n=27); B: mild periodontitis group (n=34); C: severe periodontitis group (n=31). Mean±SD. *P<0.05 vs A; #P<0.05 vs B.

2 Tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞免疫熒光雙染色結果

各組牙齦組織tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞免疫熒光雙染色結果見圖3。在正常對照組，牙齦組織tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞數量較少，表達較弱，且無明顯的脫顆粒現象；在輕度牙周炎組，牙齦組織中tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞數量增加；在重度牙周炎組，牙齦組織中出現大量tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞，肥大細胞有明顯的脫顆?，F象。各組牙齦組織中tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞密度見圖4，結果顯示，與正常對照組相比，輕度慢性牙周炎組(P<0.05)和重度慢性牙周炎組(P<0.01)牙齦組織tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞數量明顯升高；重度牙周炎組tryptase和TIM-1雙陽性肥大細胞個數顯著高于輕度牙周炎組(P<0.05)。

Figure 3. Representative photomicrographs of mast cell infiltration with tryptase-TIM-1 immunofluorescence double-staining(×1000).A: healthy control group; B: mild periodontitis group; C: severe periodontitis group.

Figure 4. Tryptase and TIM-1 double-positive mast cells in periodontal tissues of different groups. A: healthy control group (n=27); B: mild periodontitis group (n=34); C: severe periodontitis group (n=31). Mean±SD. *P<0.05,**P<0.01 vs A; #P<0.05 vs B.

討 論

TIM家族是T細胞表面的跨膜蛋白家族。研究表明，TIM-1和TIM-3是TIM家族中的2個重要成員，分別在分化成熟的Th2細胞和Th1細胞上表達，參與Th細胞免疫反應的調控。TIM-1可增強Th2細胞的活化，TIM-3可下調Th1細胞的免疫功能[8]。TIM-1最初被確認為甲型肝炎病毒細胞受體1(hepatitis A virus cellular receptor 1,HAVCR1)，后來被稱為腎臟損傷分子1(kidney injury molecule 1，KIM-1)，是哮喘和過敏的重要易感性基因，在Th2細胞上強表達，在T細胞活化中作為協同刺激分子調節機體免疫應答[9-10]。

研究顯示TIM-1在肥大細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等固有免疫細胞表面均有表達[1,11]，影響白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)、IL-10、IL-17、干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)等的釋放[12]。TIM-4是TIM-1的配體之一，TIM-1與TIM-4的相互作用調節Th細胞免疫應答及平衡Th1/Th2細胞因子[13]。T細胞活化早期，在T細胞抗原受體(T-cell receptor，TCR)刺激下，TIM-1表達增加，與其配體結合，刺激抗原呈遞細胞(antigen presenting cells，APCs)表達，為T細胞增殖提供正向的共刺激信號，同時APCs上TIM-1的表達可以直接對APCs傳遞正向信號，進而增強T細胞的活化[12,14]。臨床研究表明，甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)感染患者罹患哮喘和過敏性鼻炎的風險下降，提示TIM-1可能直接調節Th2介導的免疫應答，表達在Th2細胞表面的TIM-1與HAV結合直接改變T細胞的分化及調節Th1/Th2細胞之間的平衡[9]。實驗顯示，使用TIM-1單克隆抗體可以減少過敏原誘導的呼吸道炎癥[5]，阻斷TIM-1與配體間的相互作用可以為Th2介導的免疫應答及過敏性哮喘提供有效抗炎治療[12]。然而，TIM-1抗體在識別TIM-1的不同基因結構時，對Th1和Th2細胞因子的產生及呼吸道炎癥會出現明顯的雙重性作用。哮喘動物模型實驗結果顯示：TIM-1單克隆抗體在識別黏蛋白的外顯子4時，可以加重呼吸道炎癥及Th2細胞因子的產生；當抗體與TIM-1的IgV蛋白反應時則阻斷炎癥反應[5]。研究表明，小鼠肥大細胞能夠表達TIM-1，經IgE抗原刺激，腹腔肥大細胞或骨髓來源培養的肥大細胞TIM-1表達下調。使用重組小鼠TIM-4(rmTim-4)，能促進骨髓的肥大細胞Th2細胞因子IL-4、IL-6和IL-13的產生[1, 15]，提示TIM-1可通過調節肥大細胞的作用而影響T細胞介導的免疫反應。

牙周病是由菌斑生物引起的牙周支持組織的感染性疾病，導致牙周支持組織的破壞。目前認為由細菌激發的宿主免疫和炎癥反應造成的牙周組織破壞遠大于細菌對牙周組織的直接破壞作用[16-17]。研究顯示，牙周病免疫機制與T細胞，尤其是Th1/Th2細胞之間的調節密切相關，但關于牙周病Th1與Th2細胞作用的精確機制尚未闡明。研究發現，肥大細胞能夠分泌Th1型和Th2型細胞因子，影響T細胞的分化[18]。肥大細胞作為機體固有免疫細胞之一，參與黏膜炎癥、機體防御和組織修復等；活化的T細胞能夠激活肥大細胞脫顆粒釋放一系列介質，包括組胺、白細胞三烯、血小板激活因子、蛋白酶和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等[2,19]，引起牙周組織的破壞和牙槽骨的吸收[2, 20]。人肥大細胞根據其分泌的蛋白酶不同分為2類，一類是只能分泌tryptase的肥大細胞；另一類是能分泌tryptase、類糜蛋白酶(chymase)和羧肽酶(carboxypeptidase)的肥大細胞[21]。Tryptase為絲氨酸蛋白酶類，對中性粒細胞具有化學引誘作用，可以刺激上皮細胞增殖、分泌IL-8，刺激外周感覺神經分泌炎性神經肽誘導神經源性炎癥[2]。

本研究觀察到，tryptase陽性肥大細胞的表達量隨慢性牙周炎炎癥程度的增加而升高，慢性牙周炎中肥大細胞有明顯的脫顆粒現象，我們的結果提示肥大細胞可能通過分泌細胞因子參與慢性牙周炎的防御和破壞機制，這一結果與Batista等[2]及Huang等[3]研究結果相一致。本實驗采用免疫熒光雙染色法首次證實了人慢性牙周炎牙齦組織的肥大細胞表達TIM-1，實驗觀察到tryptase 和TIM-1雙陽性肥大細胞在正常對照組、輕度牙周炎組、重度牙周炎組中的表達逐漸增加，重度牙周炎組織中tryptase 和TIM-1雙陽性肥大細胞顯著高于輕度牙周炎組，提示肥大細胞上TIM-1的表達可能影響肥大細胞在慢性牙周炎的免疫調節作用。牙周炎是僅次于齲病的口腔常見疾病之一，與全身系統性疾病如動脈粥樣硬化、風濕性關節炎和糖尿病等密切相關，tryptase 和TIM-1雙陽性肥大細胞在牙周炎的免疫機制中的作用還有待研究，但TIM-1對炎癥的雙重性作用，可能為控制牙周炎甚至治療其全身伴發疾病提供一個新的方向。

[參 考 文 獻]

[1] Nakae S, Iikura M, Suto H, et al. TIM-1 and TIM-3 enhancement of Th2 cytokine production by mast cells [J]. Blood, 2007, 110(7):2565-2568.

[2] Batista AC, Rodini CO, Lara VS. Quantification of mast cells in different stages of human periodontal Dis[J]. Oral Dis, 2005, 11(4):249-254.

[3] Huang S, Lu F, Chen Y, et al. Mast cell degranulation in human periodontitis [J]. J Periodontol, 2013, 84(2):248-255.

[4] 藍 田, 呂芳麗, 李 娟, 等. 肥大細胞Toll樣受體4在人慢性牙周炎牙齦組織中的表達[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(8):1476-1480.

[5] Sizing ID, Bailly V, McCoon P, et al. Epitope-dependent effect of anti-murine TIM-1 monoclonal antibodies on T cell activity and lung immune responses [J]. J Immunol, 2007, 178(4):2249-2261.

[6] Armitage GC. Development of a classification system for periodontal diseases and conditions [J]. Ann Periodontol, 1999, 4(1):1-6.

[7] Huang S, Lu F, Zhang Z, et al. The role of psychologic stress-induced hypoxia-inducible factor-1α in rat experimental periodontitis [J]. J Periodontol, 2011, 82(6):934-941.

[8] Kuchroo VK, Umetsu DT, DeKruyff RH, et al. TheTIMgene family: emerging roles in immunity and disease [J]. Nat Rev Immunol, 2003, 3(6):454-462.

[9] Freeman GJ, Casasnovas JM, Umetsu DT, et al.TIMgenes: a family of cell surface phosphatidylserine receptors that regulate innate and adaptive immunity [J]. Immunol Rev, 2010, 235(1):172-189.

[10] Xiao S, Najafian N, Reddy J, et al. Differential engagement of Tim-1 during activation can positively or negatively costimulate T cell expansion and effector function [J]. J Exp Med, 2007, 204(7):1691-1702.

[11] Curtiss ML, Gorman JV, Businga TR, et al. Tim-1 regulates Th2 responses in an airway hypersensitivity model [J]. Eur J Immunol, 2012, 42(3):651-661.

[12] Umetsu SE, Lee WL, McIntire JJ, et al. TIM-1 induces T cell activation and inhibits the development of peripheral tolerance [J]. Nat Immunol, 2005, 6(5):447-454.

[13] Meyers JH, Chakravarti S, Schlesinger D, et al. TIM-4 is the ligand for TIM-1, and the TIM-1-TIM-4 interaction regulates T cell proliferation [J]. Nat Immunol, 2005, 6(5):455-464.

[14] de Souza AJ, Orisst TB, O’Malley KJ, et al. T cell Ig and mucin 1 (TIM-1) is expressed oninvivo-activated T cells and provides a costimulatory signal for T cell activation [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(47):17113-17118.

[15] Huang B, Liu M, Huang S, et al. Expression of Tim-1 and Tim-3 inPlasmodiumbergheiANKA infection [J]. Parasitol Res, 2013, 112(7):2713-2719.

[16] Deo V, Bhongade ML. Pathogenesis of periodontitis: role of cytokines in host response[J]. Dent Today, 2010, 29(9):60-62, 64-66; quiz 68-69.

[17] 黃世光, 王曉歌, 潘倩茹, 等. 慢性心理應激對大鼠實驗性牙周炎及血清乳酸脫氫酶1的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(5): 924-928.

[18] de Pater-Huijsen FL, de Riemer MJ, Reijneke RM, et al. Products from human mast cell line cells enhance the production of interferon-gamma by CD8+and CD4+T cells [J]. Immunology, 2002, 106(1):11-19.

[19] 李 紅, 趙龍鳳, 郝彥琴, 等. 抗組胺治療對實驗性肝炎大鼠肥大細胞浸潤及c-Kit和SCF表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(9): 1609-1614.

[20] Sun J, Sukhova GK, Wolters PJ, et al. Mast cells promote atherosclerosis by releasing proinflammatory cytokines [J]. Nat Med, 2007, 13(6):719-724.

[21] Pejler G, Ronnberg E, Waern I, et al. Mast cell proteases: multifaceted regulators of inflammatory disease [J]. Blood, 2010, 115(24):4981-4990.