張賢英， 張 磊， 戴桃李， 孟 甜， 李淑華， 張齊好,2△， 黃亞東,2△

(1暨南大學生命科學技術學院醫(yī)藥生物研究院， 2廣東省生物醫(yī)學工程重點實驗室，廣東 廣州 510632；3廣東省生物制品與藥物研究所，廣東 廣州 510300; 4廣州市婦女兒童醫(yī)療中心， 廣東 廣州 510623)

皮膚刺激性定義為皮膚暴露于受試物后局部產生的可逆性炎性變化。常用評價方法是由Draize等[1]建立的皮膚刺激性實驗(Draize實驗)，觀察指標包括紅斑、焦痂或水腫。然而，以動物作為受試對象，該評價體系具有明顯的缺點：天然皮膚結構不僅與遺傳、營養(yǎng)、精神狀態(tài)有關，還受生理狀態(tài)和環(huán)境因素的影響，個體差異大，重復性較差；觀察指標為表觀的定性判別，難以量化[2]。隨著國際動物保護和動物福利運動的興起，以動物替代為主的原則已成為藥品和化妝品質量檢驗的重要理念。因此，構建皮膚替代模型，開發(fā)出新的、能夠有效評價體外皮膚刺激效應的生物標志，建立完整的替代方法成為關鍵的核心問題。

在評價皮膚刺激性標記物的研究中，除了經典的細胞活性和白細胞介素1α(interleukin 1α，IL-1α)指標外[3-4]，學者嘗試將更多標志物作為刺激性評價的檢測點，以增加替代方法的敏感性和特異性，如角質形成細胞前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)表達變化以及IL-8、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)等炎癥介質的釋放[5-7]。由于藥物、化妝品等物質的皮膚毒性是非常復雜的生物過程，其效應可能是皮膚老化、接觸性皮炎、過敏反應，也可能是黑素增生、細胞癌變等。它們涉及到不同的損傷機制，既具有共性，又具有特異性。而目前所用的生物標志物雖然能滿足某些種類物質刺激性的區(qū)分，但還不足以區(qū)分不同類別的化學物質[8]，因此需要進一步尋找更多的標志物用于體外皮膚毒性實驗，以提高體外實驗方法的敏感性和特異性。本研究以歐盟規(guī)定的刺激性化合物作用于人體皮膚組織，應用蛋白組學技術篩選用于評價化合物皮膚急性刺激性的特異性生物標志。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

人體皮膚組織(由廣州市兒童醫(yī)院提供)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青)，十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate，SLS;Sigma)，3,3’-二硫代二丙酸(3,3’-dithiodipropionic acid，DA；Sigma)，10-十一碳烯酸(10-undecenoic acid，UA;Alfa)，組織裂解液{7 mol/L 尿素，4% 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(CHAPS)，2 mol/L硫脲}，水化液(2%CHAPS，7 mol/L尿素)，Ettan IPGphor Ⅲ等電聚焦系統(tǒng)(GE)，SE 600 Ruby 標準垂直電泳系統(tǒng)，預制干膠條(pH 3～10)。

2 化合物處理皮膚組織

無菌條件下，去除包皮切除術后皮膚組織的皮下脂肪，并剪成小塊，大小為0.8 mm×0.8 mm。皮膚組織放置于自制的不銹鋼網架上，采用氣液交界培養(yǎng)法培養(yǎng)，表皮面朝上，在12孔培養(yǎng)板的孔內加入0.9 mL的DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)。分別把SLS、UA和DA涂抹于皮膚表皮面：其中液體化合物取(10±1)μL；固體化合物取(10±2)mg+10 μL PBS，以利于樣品均勻分布，與皮膚表面充分接觸。作用時間為15 min，然后用無菌PBS將組織樣品反復沖洗10遍后收集樣品。

3 組織蛋白的提取

組織樣品剪碎后，加入組織裂解液充分研磨10 min。然后在冰上放置約1 h，期間不定時進行研磨。收集液體，9 000×g離心1 h，收集上清蛋白，測定蛋白濃度。

4 二維電泳

取300 μg樣品進行等電聚焦，上樣體積為250 μL。樣品與水化液混合后上樣，膠條與樣品接觸后，充分吸脹30 min，進行等電聚焦，時間約22 h，條件為：30 V 12 min；500 V 1 h；1 000 V 1 h；8 000～64 000 V 10 h；2 000 V 10 h。等電聚焦結束后，分別用含有1%二硫蘇糖醇的平衡液和含有2.5%吲哚-3-乙酸平衡液各平衡15 min。用12.5% SDS-PAGE進行第二相電泳，先每個膠15 mA，電泳15 min后，然后每個膠30 mA直至電泳結束。

固定液固定過夜，敏化液敏化30 min，水洗4次，每次10 min，0.1% AgNO3銀染40 min，簡單水洗后加入NaCO3顯色液顯色。

5 圖像和質譜分析

用ImageMaster 2D Platinum軟件分析電泳膠，蛋白點匹配后，以差異度達到2倍或者2倍以上作為具有顯著性差異的蛋白點進行質譜鑒定。從膠上挖出蛋白點，酶解后凍干。凍干的蛋白質多肽溶于3 μL 30%乙腈(含0.1%的三氟乙酸)中，點樣0.5 μL于MALDI板上，再加入0.5 μL 10 g/L α-氰基-4-羥基肉桂酸基質，晾干后，行MALDI-TOF/TOF MS質譜鑒定。完全凍干的樣品重新用0.1%三氟乙酸溶解，然后使用美國應用生物系統(tǒng)公司4800 Plus MALDI-TOF-TOF Analyzer串聯(lián)飛行時間質譜儀進行分析。質譜鑒定采用板上混合點樣方法，操作參數(shù)如下：反射模式，正離子檢測，一級質譜的質量掃描范圍為800～4 000 Da，使用標準肽混合物作為外標校正，每一個樣品質譜信號累加600～800個激光shots；對于每一個樣品，再選擇信噪比最強的且大于或等于50以上的5個峰分別作為前體離子，然后進行二級質譜分析，單個前體離子的質譜信號累加1 200激光shots。獲得的一級和二級質譜數(shù)據使用GPS Explore 3.6(美國應用生物系統(tǒng)公司)軟件進行分析，分析后的每一個樣品的一級和二級質譜數(shù)據再整合成一個文件,使用MASCOT 2.1 (Matrix Science)搜庫軟件對本地數(shù)據庫進行檢索，鑒定蛋白質。

6 Real-time RT-PCR檢測

按照Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen)的操作方法分別提取各處理組及對照組的組織總RNA，檢測RNA濃度和純度，放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩肕-MLV first-strand synthesis system試劑盒(Bio-Rad)逆轉錄為cDNA，隨后加入引物和cDNA，設計程序進行qPCR檢測。熱休克蛋白27(heat-shock protein 27,HSP27) 上游引物5’-GGACGAGCATGGCTACATCT-3’，下游引物5’-GACTGGGATGGTGATCTCGT-3’；62 ℃退火10 s；40循環(huán)；產物166 bp。GAPDH上游引物5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-AAGATGGTGATGGGATTTC-3’；60 ℃退火10 s；40循環(huán)；產物226 bp。

7 Western blotting檢測

配備12% SDS-PAGE凝膠，蛋白樣品上樣電泳；轉膜后室溫下封閉1～2 h，然后孵育Ⅰ抗(goat anti-human HSP27 antibody; Santa Cruz，1∶2 000)4 ℃過夜；以辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(Sigma-Aldrich, 1∶200)在室溫下孵育2 h；采用ECL化學發(fā)光法檢測蛋白；對蛋白條帶進行灰度分析(ImageJ)。

8 統(tǒng)計學處理

用SPSS 11.0軟件分析，數(shù)據用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 二維電泳和MALDI-TOF/TOF MS的結果

SLS、UA和DA處理皮膚組織后，提取全蛋白，進行二維電泳，共獲得約1 400個蛋白點，經過軟件分析選取了有統(tǒng)計學意義的10個蛋白表達差異點。圖1是2-D電泳圖譜，箭頭標示的是差異表達蛋白點。在這些差異表達蛋白中，HSP27表現(xiàn)為顯著上調，在SDS和UA處理組中分別上調2.86和3.66倍。圖2顯示的是HSP27在2-D圖譜中的確切位點。能夠被MALDI-TOF/TOF MS質譜分析法所鑒定的蛋白點有8個，差異倍數(shù)詳見表1。

Figure 1. Representative 2-D maps of protein expression in human skin with different treatments.N: normal group.

Figure 2. Expression of HSP27 in 2-DE maps of human skin with different treatments.

表1 MALDI-TOF/TOF MS鑒定不同處理組皮膚樣品中差異蛋白的表達

2 Real-time RT-PCR檢測HSP27 mRNA的表達

SLS和UA處理15 min后，皮膚組織HSP27 mRNA的表達并沒有發(fā)生顯著改變，見圖3。

3 Western blotting驗證HSP27蛋白的表達

與正常組比較，SLS和UA刺激使人體皮膚HSP27蛋白的表達明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而陰性對照組DA與正常組比較，HSP27的表達沒有顯著差異，見圖4。

Figure 3. The mRNA expression of HSP27 in skin tissues exposed to SLS, UA and DA detected by real-time RT-PCR.Mean±SD.n=3.

Figure 4. The protein expression of HSP27 in skin tissues exposed to SLS, UA and DA detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs N group.

討 論

在本實驗中，根據歐洲替代方法驗證中心(the European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)的測試流程[9](ECVAM SIVS, 2007)，人體皮膚組織暴露于歐盟定義的刺激性化合物SLS、UA和非刺激性化合物DA中，作用15 min后，應用雙向電泳的蛋白質組學技術，篩選出8個差異表達蛋白，其中HSP27表達顯著上調。我們的前期研究已經證實，在細胞模型中，HSP27有可能成為評價皮膚刺激性的候選生物標志。

人HSP27的分子量為27 kD，在生物體內主要有2種HSP：誘導型和構成型。誘導型HSP主要在外界環(huán)境的刺激下表達，具有保護細胞的功能；構成型HSP在生理狀態(tài)下表達，與細胞的分化、發(fā)育密切相關。應激條件下，熱休克轉錄因子(heat-shock transcription factor，HSF)與熱休克調節(jié)元件結合，激活HSP27基因,使HSP27表達增加。HSP27主要在皮膚的上皮層中表達，在多種應激條件下，誘導型HSP27表達增加，作為分子伴侶保護細胞功能[10]。紫外線[11]、加熱[12]和對羥基苯甲酸甲酯[13]都可以使角質細胞中的HSP27表達上調。HSP27能夠啟動接觸超敏反應，誘導樹突狀細胞中IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-12 p70和IL-12 p40的上調，建立接觸過敏早期階段適應性和先天免疫之間的聯(lián)系[14]。紫外線照射后誘導上調的HSP27可以調節(jié)角質細胞中促炎細胞因子IL-8和IL-1的釋放，并且還可以調節(jié)NF-κB通路依賴促炎介質的產生[15]。

在我們前期的研究已經發(fā)現(xiàn)，SLS和酸堿化合物能夠使角質細胞的HSP27表達下調[16]，重金屬則可以使HSP27表達上調[17]；而在本實驗中，SLS和UA使皮膚組織中HSP27表達上調。有研究發(fā)現(xiàn)，數(shù)小時的缺氧導致臍靜脈內皮細胞HSP27表達下調，最終導致細胞骨架崩潰死亡[18]。也就是說，HSP27蛋白表達的改變與刺激的時間、強度有關，而細胞和組織對同種刺激也會產生不同的效應。在2-D圖譜中，1號點和3號點同時鑒定為HSP27，提示HSP27可能發(fā)生了蛋白磷酸化修飾，有待后續(xù)研究進一步驗證。此外，SLS和UA處理15 min后，與蛋白表達比較，HSP27在mRNA水平上的表達并沒有發(fā)生改變，說明是在翻譯水平上調HSP27蛋白的表達，與HSP27對細胞的保護作用相關。綜上所述，HSP27有可能成為評價皮膚刺激性體外替代方法體系的候選生物標志物，其表達改變的強度需要與既定的體外模型對應。

[參 考 文 獻]

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