ANCA誘導中性粒細胞釋放正五聚素蛋白3*

謝 京， 唐 莎， 張 瑩， 尹仕偉， 高雪靜， 施維維， 王 莉， 鄒麗云， 吳玉章， 張靜波△

(第三軍醫大學 1新橋醫院腎內科， 2全軍免疫學研究所，重慶 400037)

抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic autoantibody, ANCA)相關性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)是一種自身免疫性疾病，在我國并不少見。該病變屬于慢性自身炎癥狀態持續進行的系統性小血管炎(systemic small-vessel vasculitis, SSV)，腎臟是最常累及的器官，可導致迅速進展、不可逆轉的腎功能衰竭[1]。正五聚素蛋白3 (pentraxin 3, PTX3) 作為一種新的與C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)同為正五聚素蛋白家族的急性期反應蛋白，與CRP相比，更能迅速反映局部組織的炎癥狀態及損傷，有望成為臨床更為敏感的血清學標志物[2]。PTX3以預存的方式存在于中性粒細胞中[3]。溶酶體膜蛋白2(lysosomal membrane protein 2，LAMP-2)抗體是最近才發現的ANCA 新亞型，新近研究顯示LAMP-2抗體介導了AAV的自身免疫發病過程[4]，與AAV的診斷及活動性高度相關[5]。我們前期研究發現，LAMP-2抗體可以促進中性粒細胞胞外捕網(neutrophil extracellular traps, NETs) 形成[6]。本研究旨在進一步探討傳統ANCA及新型LAMP-2抗體是否能直接誘導中性粒細胞活化，是否通過NETs形成釋放PTX3，為PTX3是否參與ANCA相關性血管炎的發病機制提供依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

二甲苯基碘(diphenyleneiodonium, DPI)和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma-Aldrich；HBSS(無Ca2+、Mg2+)、PRMI-1640培養基(無酚紅)和青/鏈霉素液購自Invitrogen；12 mm圓形蓋玻片購自Fisher；PolymorphprepTM分離液購自Axis-Shield；紅細胞裂解液購自Roche；免疫染色固定液、免疫染色封閉液、免疫染色Ⅰ抗稀釋液、免疫染色熒光Ⅱ抗稀釋液、抗熒光淬滅封片劑、DAPI等購自上海碧云天公司。TNF-α購自PeproTech；PTX3 ELISA試劑盒購自Cusabio，檢測范圍為0.156～10 μg/L；FITC標記的抗人CD16流式抗體購自BioLegend；抗LAMP-2 IgG(H4B4)、FITC標記小鼠抗人髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)單抗(266.6k2)和小鼠抗人PTX3 IgG抗體均購自Santa Cruz；小鼠抗人IgG2a單克隆抗體購自Abcam；所有熒光Ⅱ抗包括TRITC標記的羊抗小鼠熒光Ⅱ抗購自北京中衫金橋公司。

2 主要方法

2.1健康對照組及AAV患者全血及血清收集 選擇健康志愿者9例作為對照組，來源于第三軍醫大學附屬新橋醫院體檢中心；AAV患者6例，來源于第三軍醫大學附屬新橋醫院腎內科，入選標準為：2012年美國Chapel Hill會議(CHCC)關于系統性血管炎命名分類法、分型及1999年美國風濕病學會(ACR)修訂的血管炎診斷標準[7-8]。排除標準為：系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎及過敏性紫癜、IgA腎病等繼發性的血管炎和近期接受免疫抑制劑治療的患者?；颊咂骄挲g60.2歲,男性2例，女性4例。其中血清MPO-ANCA陽性5例，且平均滴度1∶68.4；PR3-ANCA陽性 1例，滴度1∶100。腎活檢其中3例為新月體腎小球腎炎，1例硬化性腎小球腎炎，2例因雙腎彩超提示血流信號稀少及縮小未進行腎活檢。全血和血清均為在臨床確診，接受治療前收集樣本。健康志愿者和AAV患者血清收集后，經2 000 r/min離心15 min后，取上清液置于Eppendorf管，于-80 ℃冰箱保存。本研究經第三軍醫大學新橋醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

2.2中性粒細胞的分離、存活率鑒定及培養 采用PolymorphprepTM分離液分離健康志愿者和AAV患者EDTA抗凝全血，加入中性粒細胞分離液后離心，取出中性粒細胞層和下面的分離液層，加入HBSS(無Ca2+、Mg2+)洗滌后裂解殘余紅細胞，CD16標記的流式細胞術鑒定中性粒細胞純度。細胞用無酚紅RPMI- 1640培養基(1%青/鏈霉素)以5×(105～106)接種于加有12 mm圓形蓋玻片的24孔板中，每孔500 μL，貼片1 h后，分別設立相應的刺激組進行培養。分離后0 h及培養3 h的中性粒細胞進行臺盼藍染色，取細胞懸液450 μL與0.4%臺盼藍溶液50 μL以9∶1輕輕混合混勻(終濃度0.04%)；倒置顯微鏡下觀察并拍照，死細胞染成明顯的藍色，活細胞拒染呈無色透明狀。在3 min內分別計數活細胞和死細胞：細胞存活率(%)= 活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%。

2.3實驗分組 分離健康志愿者中性粒細胞進行分組培養：(1) LAMP-2抗體刺激組：采用抗LAMP-2 IgG (20 mg/L)，參照文獻[6]； TNF-α組：TNF-α(20 μg/L)，刺激為陽性對照，參照文獻[9]。(2)血清刺激中性粒細胞組：AAV患者血清作為實驗組，TNF-α+AAV患者血清作為陽性對照，健康人血清組作為陰性對照，刺激時間180 min。TNF-α組預處理60 min后，再用患者血清刺激120 min。培養條件為37 ℃、5% CO2。(3)健康志愿者及AAV患者中性粒細胞上清組：收集健康志愿者及AAV患者全血分離后的中性粒細胞上清待測。僅加培養基的中性粒細胞作為空白對照組。

2.4免疫熒光及激光共聚焦技術檢測PTX3的表達 分離后的中性粒細胞經處理或未處理后固定，洗滌3次后4 ℃封閉過夜，以小鼠抗人PTX3-IgG為Ⅰ抗，以稀釋好的TRITC 羊抗小鼠熒光IgG抗體(1∶200)作為Ⅱ抗標記PTX3；FITC標記的抗中性粒細胞顆粒蛋白熒光抗體，37 ℃孵育60 min，洗滌3次后，DAPI復染標記DNA，抗熒光淬滅封片劑封片后以Leica SP5激光共聚焦顯微鏡觀察和記錄熒光圖像，用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量熒光強度，結果以目的蛋白的平均熒光強度值表示。

2.5ELISA法測定各組細胞上清PTX3水平 中性粒細胞經分組處理培養后，收集上清液，步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行檢測，用酶標儀分析出波長450 nm處的A值，代入CurveExpert 1.4軟件，分析ELISA標準曲線擬合方程及數據，計算出各組細胞上清液中PTX3水平。

3 統計學處理

實驗每次采用3個復孔。中性粒細胞來源于9個不同的健康志愿者。用GraphPad Prism 5.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用非配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 分離的中性粒細胞純度及存活率

分離的健康志愿者中性粒細胞經CD16標記的流式細胞術鑒定，純度>95%。剛分離(0 h)的健康志愿者中性粒細胞平均存活率為97%，AAV患者的中性粒細胞平均存活率95.7%，2組間無顯著差異(P>0.05)。健康志愿者中性粒細胞體外經過3 h的培養，單獨培養基組平均存活率為94.9%，健康志愿者血清刺激組平均存活率為95.2%，LAMP-2抗體(20 mg/L)刺激組平均存活率為94.0%，AAV血清刺激組平均存活率為94.2%，TNF-α刺激組平均存活率為93.5%，AAV血清+TNF-α刺激組平均存活率為94.9%，各組間無顯著差異(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. The survival rate of neutrophils tested by Trypan blue exclusion assay.HC: health control.Mean±SD.n=3.

2 PTX3儲存在靜止狀態的正常中性粒細胞中

分離的健康志愿者中性粒細胞，不予以任何刺激，在培養基中培養180 min，然后用 DAPI 進行核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核形態變化，絕大多數中性粒細胞保持正常的分葉核結構，間接免疫熒光染色發現PTX3儲存在靜止狀態的中性粒細胞中，細胞外無PTX3的釋放，見圖2。

Figure 2. PTX3 was stored in resting normal neutrophils. Scale bars:25 μm.

3 AAV患者中性粒細胞釋放PTX3增加

由健康人及AAV患者外周血分離的中性粒細胞直接離體培養180 min后，收集培養上清，經ELISA檢測發現來自AAV患者中性粒細胞的體外培養上清中的PTX3水平明顯高于健康人中性粒細胞培養上清中的PTX3水平，且差異具有統計學意義(P<0.05),見圖3。

4 LAMP-2抗體促中性粒細胞PTX3的釋放

分離健康志愿者的中性粒細胞分別經培養基(作為對照)、LAMP-2 抗體(20 mg/L)和TNF-α刺激180 min 后，收集培養上清，通過ELISA檢測發現：LAMP-2抗體刺激健康人外周血中性粒細胞組，上清中PTX3水平明顯高于培養基對照組(P<0.01),但低于陽性對照的TNF-α組。3組間均有顯著差異(P<0.01)，見圖4。

5 LAMP-2抗體及AAV患者血清可通過NETs的形成釋放PTX3

分離健康志愿者的中性粒細胞經LAMP-2 抗體或TNF-α分別刺激180 min 后，用DAPI 進行核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核形態變化。在未加任何刺激因子的培養基陰性對照組，絕大多數中性粒細胞保持正常的分葉核結構，PTX3固定在胞內，幾乎無PTX3的釋放；LAMP-2 抗體刺激組中性粒細胞核變形，分葉消失，染色質解聚呈網狀釋放出胞外，發現大量PTX3釋放；TNF-α刺激組同樣發現大量PTX3釋放；分離的中性粒細胞經健康人血清刺激后絕大多數中性粒細胞保持正常的分葉核結構，且PTX3固定在胞內；AAV患者血清刺激組中性粒細胞核變形，分葉消失，染色質解聚呈網狀釋放出胞外，發現大量PTX3釋放；TNF-α預刺激后加AAV患者血清組同樣發現大量PTX3釋放。通過圖像分析軟件測量PTX3免疫熒光強度顯示，與單獨培養基組相比，LAMP-2抗體刺激組的PTX3免疫熒光強度明顯增高，2組間差別有統計學意義(P<0.01)；用AAV患者血清刺激正常人中性粒細胞組明顯高于健康血清刺激組，2組間差別有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

Figure 3. High supernatant PTX3 level in cultured neutrophils isolated from the AAV patients.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs health control (HC).

Figure 4. PTX3 was released from the neutrophils stimulated by LAMP-2 antibody (Ab). Mean±SD.n=9.**P<0.01 vs medium.

Figure 5. PTX3 was released through neutrophils extracelluar trap formation.Scale bars:25 μm. Mean±SD.n=9.**P<0.01 vs medium; ##P<0.01 vs HC serum.

6 PTX3隨中性粒細胞胞內抗原MPO通過NETs形成釋放

分離健康志愿者的中性粒細胞經LAMP-2抗體或TNF-α刺激180 min 后，對刺激后的中性粒細胞進行免疫熒光染色，用小鼠抗人PTX3 IgG抗體作為Ⅰ抗、TRITC羊抗小鼠IgG2a單克隆抗體及FITC標記的抗MPO熒光抗體作為Ⅱ抗，DAPI 標記DNA，激光共聚焦顯微鏡進行觀察，結果顯示，LAMP-2 抗體誘導中性粒細胞形成NETs，導致PTX3隨MPO一起釋放，見圖6。

討 論

AAV是進展非常迅速的系統性疾病，ANCA 不僅是診斷AAV的標準，同時也直接參與了病理損傷進程[9]。但ANCA并不與所有病人的活動性相關，提示還存在其它伴隨疾病活動的生物學標志[10-11]。既往研究發現，PTX3可以作為AAV患者疾病活動性的獨立預測因子[12]，但具體機制依然不清。

Figure 6. PTX3 was released along with MPO through the neutrophil extracelluar trap formation. Scale bars: 25 μm.

PTX3是近年發現的，與短肽鏈的CRP和SAP同家族的一種新的長肽鏈正五聚素蛋白。PTX3可由眾多炎癥細胞及組織固有細胞產生。這些細胞包括：樹突狀細胞、巨噬細胞、纖維母細胞、激活的內皮細胞、腎臟系膜細胞、平滑肌細胞等，還以預存的方式儲存于中性粒細胞的特殊顆粒里[13]，作為一種可溶性模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，在炎癥因子及病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)刺激下可釋放出胞外[14]。PTX3通過巨噬細胞調節晚期凋亡中性粒細胞的清除，參與了自身免疫[15-16]；此外，還通過與C1q的結合，激活補體途徑，而在補體介導的免疫反應中起到雙重作用[17]。本研究首先從形態學上證實了PTX3儲備在正常并處于靜止狀態的中性粒細胞中，然后在臨床收集的AAV患者全血中分離的中性粒細胞培養上清中檢測到PTX3水平明顯高于健康對照組，提示AAV患者的中性粒細胞可能釋放PTX3增加。有文獻顯示：中性粒細胞受TNF-α刺激后發生凋亡，儲存在中性粒細胞特殊顆粒內的PTX3隨即釋放出胞外[14]。

NETs是一種不同于凋亡和壞死的中性粒細胞一種新的死亡方式，是以中性粒細胞核內或線粒體內DNA及組蛋白為骨架，負載胞內抗微生物分子組成的網狀結構，作為中性粒細胞抵御外來微生物的第一道防線，以胞吐的方式釋放DNA及水解酶，捕獲入侵的病原微生物，形成高濃度的殺菌微環境[18]。NETs釋放的組分中，經蛋白質組學測定，有24種NETs相關性蛋白[19]，這些蛋白基本上都具有抗微生物活性，與宿主防御相關，PTX3即為其中之一[13]。本研究隨后采用ANCA新亞型LAMP-2抗體刺激正常人中性粒細胞，同樣發現其培養上清中存在高水平的PTX3蛋白，進一步采用免疫熒光方法從形態學證實了PTX3的釋放，以及熒光強度定量檢測到刺激后的中性粒細胞PTX3釋放增加。同樣，含ANCA陽性的AAV患者血清體外刺激正常人中性粒細胞，與LAMP-2抗體刺激具有相似的結果，免疫熒光及熒光強度定量檢測到患者血清刺激后的中性粒細胞釋放出大量的PTX3。這提示PTX3釋放可能依賴于ANCA及其它微環境細胞因子， ANCA新亞型LAMP-2抗體與AAV血清中檢驗確定的傳統ANCA(MPO-ANCA及PR3-ANCA)一樣，都能誘導中性粒細胞的PTX3釋放。本課題組早期研究發現：LAMP-2抗體誘導的NETs網狀結構組分中含有MPO等自身抗原[6]。自身抗原的過度暴露而未及時清除，可以直接損傷機體組織，還能進一步誘導自身抗體的形成，加重AAV的發病進程[9]。我們用激光共聚焦顯微鏡觀察，從形態學上發現中性粒細胞通過NETs形成導致PTX3隨自身抗原MPO一同釋放，PTX3構成NETs的組份。PTX3作為可溶性識別受體，具有類似抗體的功效，可能在NETs中通過與某種配體的結合，清除過度暴露的自身抗原，清除異常死亡的中性粒細胞，發揮出中和清除病原體的生物學效應，而起到限制自身免疫的保護性作用[20-21]。

本研究尚有以下不足之處：因本課題組在臨床研究部分發現AAV患者血清PTX3水平升高，與文獻報道的小血管炎患者血清中PTX3水平升高相似[12]。因此，在用AAV患者血清刺激組中，考慮到患者血清中含有PTX3，與正常人外周血中性粒細胞經其刺激后釋放出的PTX3相互產生干擾，尚未設立用AAV患者血清刺激正常人外周血中性粒細胞組。僅用熒光檢測從形態學上發現了與抗體刺激組相同的PTX3釋放。無論是體外或動物實驗中，進一步探討PTX3在AAV中的作用是本研究需要繼續關注的問題。

綜上所述，本研究發現靜止狀態的正常中性粒細胞中儲存PTX3，AAV患者外周血中性粒細胞培養上清中存在高水平PTX3，而這些PTX3可由中性粒細胞通過胞外捕網形成進行釋放。該發現將為我們進一步認識這一特殊的可溶性識別受體在AAV病理生理過程中的作用及可能機制奠定基礎。

[參 考 文 獻]

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