王 妮, 陳新玉, 歐小利, 姜 勇, 梅柱中

(南方醫科大學病理生理教研室，廣東省功能蛋白質組學重點實驗室，廣東 廣州 510515)

泛素(ubiquitin)存在于所有真核細胞中，是一種高度保守的含76個氨基酸殘基的蛋白，游離存在于細胞內或共價綴合到各種胞漿、核和整合的膜蛋白上[1]。可通過其羧基端的甘氨酸殘基與靶蛋白分子中特定的賴氨酸殘基形成共價連接，被稱之為蛋白質的泛素化修飾，是蛋白質翻譯后修飾的一種重要形式。依底物蛋白質分子中形成的多聚泛素鏈的不同可促進其通過26S泛素蛋白酶體系統(ubiquitin proteasome system，UPS)被降解(如通過K48形成的多聚泛素鏈)或調節其在細胞中的功能(如通過K63形成的多聚泛素鏈)。蛋白質的泛素化降解涉及3個步驟：第1步，泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)利用ATP激活泛素并與泛素以共價鍵結合；第2步，激活的泛素從E1轉移到泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)；一些E2可直接把泛素傳給底物，大多數情況則需要第3步，即泛素連接酶(ubiquitin ligase,E3)識別特定的底物，并把泛素傳給底物賴氨酸[2]。其中E3連接酶處于核心的地位，它通過與底物蛋白質的直接結合而促進其發生泛素化修飾，保證了發生泛素化修飾的底物蛋白質的特異性[3]。目前在哺乳動物細胞中已經被鑒定的E3連接酶超過600種，依據其結構的不同可以大體上劃分為兩大類：HECT(homologous to E6AP C-terminus)家族蛋白和含有RING(really interesting new gene)結構域的E3連接酶，其中前者是單一亞基的酶類，可直接促進底物蛋白質分子的泛素化修飾，而后者多是由多個亞基組成的，以蛋白復合物的形式來行使E3連接酶的活性[4]。

在含有RING結構域的E3連接酶中，2003年被鑒定的含有BTB-Kelch結構域的蛋白家族，即KLHL(Kelch-like)蛋白家族在其氨基末端含有保守的BTB(Bric-a-brac, Tramtrack and Broad complex)結構域，在其羧基端含有5～6個Kelch結構域，它們可通過BTB結構域與Cul-3/Rbx1結合形成E3連接酶復合物，而通過其羧基端與底物蛋白質分子結合[5-7]。該家族成員在進化中高度保守，提示它們在細胞中具有重要的生理功能，但在已被鑒定的42種成員中，除了少數幾種之外，絕大部分成員的功能目前尚不清楚[8]。我們在前期對美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)高通量基因表達數據庫進行分析時，發現采用Toll樣受體5(Toll-like receptor 5，TLR5)的特異性配體鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白(flagellin fromS.typhimurium,ST-FLA)刺激CD11c+的小鼠小腸黏膜固有層(lamina propria)細胞4 h可誘導KLHL家族蛋白中的KLHL32表達水平下調[9](數據庫編號GDS2212)，提示其可能與細胞的炎癥反應調控有關。為了進一步的分析KLHL32蛋白在炎癥反應中的功能，我們用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)誘導分化的人THP-1單核巨噬細胞克隆了該基因，并對其功能進行了初步的分析，為后續深入研究KLHL32蛋白在細胞炎癥反應中的功能打下了良好的基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

真核表達載體pcDNA3.1-FLAG、THP-1細胞系和人胚胎腎293(human embryonic kidney 293, HEK293)細胞(本室保存)；DNA Ladder、KOD Plus DNA聚合酶和ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo);限制性內切酶和T4 DNA連接酶(Thermo);質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和SYBR Green Real-Time PCR試劑盒(Promega);TRIzol總RNA提取試劑和Lipofectamine LTX轉染試劑盒(Life Technology);anti-FLAG M2抗體和PMA(Sigma-Aldrich);ST-FLA (Invivogen);anti-cullin-3(Cul-3)兔單克隆抗體(Epitomics);anti-mouse IgG, HRP-linked antibody(Cell Signaling Technology)。引物合成及測序由Life Technology完成。

2 主要方法

2.1實時熒光定量PCR檢測C57BL/6小鼠不同組織KLHL32 mRNA的表達 頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，將新鮮取出的心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、皮膚等8種組織裝入凍存管中，置于液氮中進行速凍，30 min后取出組織加一定量液氮充分研磨至完全粉碎。按每50 mg組織樣品加TRIzol? Reagent 1 mL的量加入適量的TRIzol試劑，提取組織中總RNA并采用real-time PCR檢測不同組織中KLHL32 mRNA的表達水平，以28S rRNA為內參照。小鼠KLHL32上游引物5’-CAGCAAAGAAGTGATGGCATTC-3’, 下游引物5’-GCTCCACTTTCCACCATACAAAG-3’；小鼠28S rRNA上游引物5’-GAGATTCCCACTGTCCCTACCTACT-3’，下游引物5’-GAGTCAAGCTCAACAGGGT-CTTC-3’。

2.2PMA誘導THP-1細胞的分化及采用實時熒光定量PCR檢測KLHL32 mRNA的表達水平變化 THP-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 于37 ℃、5% CO2條件下在3.5 cm培養皿中培養。PMA誘導THP-1分化為巨噬細胞參考已發表文獻[10]，取3×105THP-1單核細胞接種于3.5 cm細胞培養皿中，加入10 μg/L PMA，混勻后置37 ℃培養48 h，吸棄培養基，采用PBS緩沖液洗2次，再加入無血清的RPMI-1640培養基于37 ℃繼續培養4 h。然后吸棄無血清的RPMI-1640培養基，加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養基，同時加入TLR5激活劑ST-FLA至終濃度為100 μg/L。置37 ℃繼續培養4 h后收集細胞，采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并測定其濃度和純度。以Roche公司的反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板進行real-time PCR檢測，人KLHL32上游引物5’-GCGACATCACCCTGATTGCT-3’，下游引物5’-CATCAGCTCCACTTTCCACCAT-3’；內參照人β-actin上游引物5’-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3’，下游引物5’-TCTCAAACATGATCTGGGTCATCT-3’。具體方法參照Invitrogen公司SYBR Green Real-Time PCR試劑盒說明書。

2.3pcDNA3.1-KLHL32-FLAG真核表達質粒的構建 以上述反轉錄的THP-1細胞cDNA為模板，采用PCR技術擴增人KLHL32基因的編碼序列。PCR上游引物5′-GTGGTACCGCTGGAAAATGCCGTCTGAAC-3′(下劃線為KpnI位點)，下游引物5′-GCTCTAGAGATGGTGCCAATCCTGTGATG-3′(下劃線為XbaI位點)，擴增片段大小為1 884 bp。采用高保真DNA聚合酶KOD Plus進行PCR擴增，反應條件為94 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min,68 ℃ 2 min，共35個循環。將經KpnI和XbaI雙酶切的PCR擴增產物克隆至采用同樣雙酶切的真核表達載體pcDNA3.1-FLAG中，重組質粒經限制性酶切鑒定與DNA測序證實，命名為pcDNA3.1-KLHL32-FLAG，表達的蛋白為羧基端含有FLAG標簽的KLHL32融合蛋白。

2.4KLHL32蛋白BTB結構域突變體質粒的構建 通過將KLHL32蛋白的BTB結構域與Keap1和MEL-26蛋白的BTB結構域采用Clustal多序列對位排列軟件進行分析，結果顯示它們之間具有高度的同源性，其中Val83/Leu85/Gly87與已報道的MEL-26蛋白和人Keap1蛋白BTB結構域中參與同Cul-3蛋白相互結合的氨基酸殘基高度同源[7, 11](圖1)。為了分析它們對KLHL32與Cul-3結合的可能影響，以pcDNA3.1-KLHL32-FLAG質粒為模板，采用QuickChange點突變試劑盒(Stratagene)將它們同時突變為Ala。突變引物1序列5′-GTGGAGCTGATGAGGCTAATGCGCACGCTGTGACCAGCCTTG-3′，引物2序列5′-CAAGGCTGGTCACAGCGTGCGCATTAGCCTCATCAGCTCCAC-3′。 具體的操作依據其說明書進行，獲得的陽性克隆經DNA序列分析驗證后備用，命名為pcDNA3.1-KLHL32M-FLAG。

Figure 1. Alignment of BTB domains from human KLHL32, Keap1 and MEL-26.

2.5脂質體介導的瞬時轉染和表達 HEK293細胞用含有10% FBS的DMEM，置于5% CO2培養箱中，37 ℃培養。轉染前24 h內傳代并將細胞接種于6 cm細胞培養皿中，待其長至約70%融合時，根據Invitrogen公司Lipofectamine? LTX and PLUSTMReagents試劑盒說明書操作，轉染1 μg重組質粒pcDNA3.1-KLHL32-FLAG和空載體質粒pcDNA3.1-FLAG (對照)。轉染后細胞置于5% CO2培養箱中，37 ℃繼續培養24 h。

2.6免疫共沉淀與Western blotting檢測 轉染24 h后收集細胞，采用300 μL細胞裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0, 0.2% Triton X-100, 150 mmol/L NaCl, 5% glycerol, 2 mmol/L EGTA, 1 mmol/L DTT，1×蛋白酶抑制劑)裂解細胞(冰浴1 h)，然后于12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清。取30 μL細胞裂解上清加入10 μL 4×SDS-PAGE上樣緩沖液，95 ℃ 5 min，為細胞全裂解液，-20 ℃保存備用。在剩余的裂解上清中各加入2 μL抗FLAG單克隆抗體，置旋轉混勻儀上4 ℃孵育4 h，然后再加入20 μL protein A/G瓊脂糖凝膠，4 ℃孵育過夜，再采用裂解緩沖液洗瓊脂糖凝膠4次，最后一次離心后吸棄上清，于每管中加入40 μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，95 ℃ 5 min，為免疫共沉淀樣品。分別將全細胞裂解液與免疫共沉淀樣品采用12% SDS-PAGE進行分離，電泳結束后將蛋白電轉移至NC膜。經5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h后，再與1∶2 000稀釋的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，然后與1∶2 000稀釋的HRP偶聯的抗鼠IgG室溫孵育1 h后，采用Pierce公司的SuperSignal West Pico化學發光底物進行顯色，利用Kodak IS2000R 圖像工作站進行化學發光檢測。

3 統計學處理

數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，統計學分析采用t檢驗。

結 果

1 KLHL32蛋白的鑒定

通過對NCBI數據庫的進一步分析，我們發現人KLHL32基因定位于染色體的6q16.1區，全長216 kb，編碼蛋白含有620個氨基酸殘基，含有1個BTB結構域與5個重復的Kelch結構域，在這2個結構域之間還存在1個BACK(BTB and C-terminal Kelch)結構域，見圖2。該蛋白在進化中高度保守，如爪蟾KLHL32蛋白與人KLHL32蛋白的保守性高達95%，提示其在生物體內可能具有非常重要的功能。

Figure 2. Schematic diagram of BTB protein KLHL21.

2 KLHL32 mRNA在小鼠不同組織中的表達水平

用β-actin為內參照，采用定量PCR對KLHL32 mRNA在小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉與皮膚等8種組織中表達水平的分析結果顯示，KLHL32 mRNA在腦里面的表達水平最高，其次為心與腎組織，而在皮膚里的表達水平最低，當以肺內的KLHL32表達水平為基準時(設為1)，則其在另外7種組織中的相對表達水平依次為：腦29.94±2.21、心12.88±1.53、肝0.21±0.05、脾0.09±0.04、腎12.52±1.25、肌肉0.78±0.26與皮膚0.43±0.14，見圖3。為了進一步驗證該結果的可靠性，我們又用28S rRNA為內參照重復上述實驗，結果顯示當以肺內的KLHL32表達水平為基準時(設為1)，則其在另外7種組織中的相對表達水平依次為：腦17.39±2.52、心6.88±3.49、肝0.11±0.03、脾0.15±0.08、腎5.98±2.52、肌肉0.27±0.11與皮膚0.002±0.001，與采用β-actin為內參照的實驗結果相似，只是比例上存在差異(圖未顯示)。

3 ST-FLA激活TLR5受體誘導KLHL32 mRNA表達下調

Figure 3. Relative expression of KLHL32 mRNA in different tissues of mouse.Mean±SEM. n=3.

100 μg/L ST-FLA刺激THP-1巨噬細胞4 h可誘導KLHL32 mRNA水平顯著下調(0.57±0.07，P<0.01)，而作為陽性對照的IL-8表達水平上調，為未誘導時的(7.03±1.89)倍(P<0.01)，提示KLHL32可能參與了TLR5激活下游的信號轉導通路，見圖4。

Figure 4. The mRNA expression of KLHL32 was down-regulated in THP-1 cells upon ST-FLA treatment.Mean±SEM. n=3. **P<0.05 vs control.

4 KLHL32蛋白對NF-κB報告基因表達的影響

KLHL32蛋白對TNF-α誘導的NF-κB轉錄因子活性沒有明顯影響，見圖5。

5 KLHL32與Cul-3蛋白在HEK293細胞中存在相互結合

在HEK293細胞中，KLHL32蛋白與Cul-3蛋白之間存在特異性的結合。為了進一步分析KLHL32蛋白中的BTB結構域是否參與了與Cul-3蛋白的結合，將其保守的氨基酸殘基Val83/Leu85/Gly87同時突變成丙氨酸(Ala)，免疫共沉淀實驗結果顯示該突變體在細胞中與Cul-3蛋白不能結合，表明KLHL32是通過其氨基端的BTB結構域與Cul-3蛋白相互結合，見圖6。

Figure 5. Over-expression of KLHL32 in HEK293 cells didn’t interfere the activation of NF-κB upon TNF-α treatment.Mean±SEM.n=3.

Figure 6. KLHL32 interacted with Cul-3 protein through its BTB domain.

討 論

KLHL32蛋白屬于進化中高度保守KLHL蛋白家族，該家族成員可通過其氨基端的BTB結構域與Cul-3蛋白相互結合形成E3泛素連接酶，催化底物蛋白質的泛素化修飾，但目前對KLHL32蛋白的研究尚未見報道。本研究首先通過NCBI高通量基因表達數據庫的分析，發現特異性激活CD11c+的小鼠小腸黏膜固有層細胞中的TLR5受體4 h可誘導KLHL家族蛋白中的KLHL32表達水平的下調。為了驗證這一結果，我們采用TLR5特異性配體ST-FLA激活經PMA誘導分化的THP-1巨噬細胞，結果顯示激活TLR5受體確實可以誘導KLHL32 mRNA表達水平的下調，提示KLHL32蛋白可能參與了TLR5受體下游信號通路的調控。

TLR5受體主要表達于單核細胞，在巨噬細胞中低表達，其特異性配體是細菌的鞭毛蛋白。其被激活后可通過接頭蛋白MyD88的介導，激活下游NF-κB轉錄因子與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，繼而促進促炎細胞因子(pro-inflammatory cytokine)如TNF-α、白細胞介素1與I型干擾素等的表達，構成宿主對抗細菌感染的第一道防線[12]。本結果顯示KLHL32蛋白對TNF-α誘導的NF-κB轉錄因子活性并無明顯影響，其具體機制尚有待進一步的實驗來揭示。

免疫共沉淀實驗結果證實了KLHL32蛋白在細胞中與Cul-3之間存在相互作用，而且它們之間的相互結合依賴于其氨基端保守的BTB結構域，提示其在細胞中可能是一種潛在的E3泛素連接酶，催化底物蛋白質分子的泛素化修飾。泛素化修飾是蛋白質一種重要的翻譯后修飾形式，它在細胞中不僅可以促使靶蛋白分子通過泛素蛋白酶體途徑被降解，也可以參與調控靶蛋白質分子在細胞中的定位與功能，而近年來的研究表明，蛋白質的泛素化修飾在TLR受體被激活后的下游信號轉導通路中起著不可或缺的作用[13]。為了分析KLHL32蛋白在炎癥信號轉導通路中的可能作用，我們將其與受NF-κB轉錄因子調控的報告基因表達載體共轉染HEK293細胞，然后再采用TNF-α進行刺激，結果顯示KLHL32蛋白對TNF-α激活的NF-κB轉錄因子活性沒有明顯影響。導致這一結果的原因可能是因為TNFR1受體被TNF-α激活與TLR5受體被激活后的下游信號通路不同所致，也可能是因為報告基因檢測所采用的是HEK293細胞，而非TLR5表達的單核細胞如PMA誘導分化的THP-1細胞。此外，KLHL32蛋白在細胞中也有可能并不參與對TLR5激活的NF-κB信號通路的調控，而是參與對其它下游信號轉導通路如MAPK通路的調控。對KLHL32蛋白功能的深入研究有賴于鑒定其特異性的底物蛋白分子，并分析其促進底物蛋白泛素化修飾對底物蛋白功能的影響。

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