于 軍， 陳寶瑩， 趙 鴿， 張學策， 趙海康

(1西安醫學院第二附屬醫院中心實驗室，陜西 西安 710038； 2第四軍醫大學基礎醫學教學實驗中心，陜西 西安 710032；3第四軍醫大學唐都醫院放射科，陜西 西安 710038； 4西安交通大學醫學院第一附屬醫院麻醉科，陜西 西安 710061； 5西安醫學院第二附屬醫院神經外科，陜西 西安 710038)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的進行性的中樞神經系統退行性病變，以大腦黑質(substantia nigra，SN)多巴胺能(dopaminergic，DA)神經元的缺失為主要特征。PD患者的主要癥狀包括：靜止性震顫、僵直、步態異常等[1-2]。因此，保護DA神經元免受損傷對于防治PD有重要的意義。

1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)是一種環境毒素，常被用作復制帕金森病的細胞和動物模型[3]。MPP+不僅抑制線粒體復合物I的活性，還引起微管解聚，導致軸突斷裂并降低神經突觸的功能[4-6]，而且MPP+還可以直接抑制DA神經元的軸漿轉運，從而破壞神經的功能，并造成DA神經元缺失[7-8]。

鈉尿肽(natriuretic peptides，NPs)是一組結構相似的多肽，包括心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和C型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)[9]。ANP、BNP和CNP分別含有28、32和22個氨基酸，都有17個氨基酸形成環狀結構。血管鈉肽(vasonatrin peptide，VNP)是一種人工設計合成的新型鈉尿肽，在結構上是CNP與ANP的雜合體，由CNP的環狀結構與ANP的羧基端嵌合而成[10]。NPs通過與鳥苷酸環化酶(guanylyl cyclase，GC)偶聯的鈉尿肽受體(natriuretic peptide receptors，NPR)NPR-A或NPR-B結合，升高細胞內的cGMP水平，而發揮其作用。NPR-A或NPR-B可以被HS-142-1(一種來自真菌的多糖)選擇性阻斷[11]。ANP和BNP主要與NPR-A結合，CNP主要與NPR-B結合。

近年來發現，NPR在包括嚙齒類的多種動物，以及包括腦的多種組織中廣泛表達[12-13]。VNP的心血管作用已經比較清楚，但是它的神經效應如何還不清楚。因此，本研究的目的旨在闡明VNP對MPP+所致DA神經元損傷的作用，并揭示其信號轉導機制。

材 料 和 方 法

1 試劑

Neurobasal細胞培養基、B27和胰酶消化液購自Invitrogen。阿糖胞苷(arabinosylcytosine，Ara-C)、多聚賴氨酸(poly-D-lysine)、MPP+、KT-5823和8-溴環鳥苷酸(8-bromo-cyclic guanylic acid，8-Br-cGMP)均購自Sigma。VNP由江南大學合成。HS-142-1由魏啟明教授惠贈(John Hopkins University，USA)。[125I]-cGMP放免測定試劑盒購自上海中醫藥大學。

2 細胞培養

C57BL/6小鼠(14日齡)購自第四軍醫大學實驗動物中心，本研究的動物實驗得到西安醫學院倫理委員會的許可。胎屬中腦腹側細胞的原代培養參照以往的報道進行[14-15]。14日齡的孕鼠吸入CO2麻醉、消毒。取出胎鼠，解剖顯微鏡下分離中腦腹側的組織。生理鹽水沖洗后，剪碎。所有的操作都在冰上進行。剪碎的組織于37 ℃、0.125%胰酶中消化15 min后，移入含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Invitrogen)培養基離心管。離心，用含2% B27、9 g/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的Neurobasal培養基重新懸浮，成為單細胞懸液。接種于放置有預包被多聚賴氨酸玻片的24孔細胞培養板，接種密度為5×105/L。于37 ℃、含5% CO2孵箱中培養，每2 d更換一半培養液。在第4天，培養液中加入10.0 μmol/L阿糖胞苷。48 h后更換為不含阿糖胞苷的培養液。整個培養過程為7 d。

3 細胞活力分析

細胞活力采用MTT比色的方法進行分析。細胞接種于96孔細胞培養板，接種密度為1×109/L，每孔培養液體積為100 μL。細胞培養液中加入不同濃度的MPP+(0.1、0.5、1.0和10.0 μmol/L)或者特異性的阻斷劑或抑制劑，每組設定6個平行孔。分別在6、12和24 h檢測細胞活力。每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)。繼續培養4 h，棄培養液，每孔加入100 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min，490 nm測定吸光度(absorbance，A)。實驗重復3次。

4 免疫熒光染色

貼附于蓋玻片上的細胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，用含0.3% Triton X-100的1% BSA封閉非特異性位點(室溫，1 h)。小鼠抗酪氨酸羥化酶單克隆抗體(1∶3 000，Sigma)4 ℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，之后，Alexa Fluor-594標記的驢抗小鼠IgG(1∶400，Molecular Probes of Invitrogen)室溫孵育2 h。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，之后，Hoechst 33342 (1∶50)室溫孵育20 min復染細胞核。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，之后，固定。

熒光顯微鏡觀察，酪氨酸羥化酶陽性細胞代表多巴胺神經元。在每個玻片上隨機選取5個高倍(×40)視野，計算酪氨酸羥化酶陽性細胞的平均數。細胞計數、軸突的數目和長度分析均用Image-Pro Plus 6.0軟件。

5 細胞內cGMP水平測定

細胞接種于90 mm細胞培養皿(每個培養皿1×106細胞)用于放免分析。細胞經過同步化之后，將細胞孵育于含不同濃度VNP的無血清培養基。HS-142-1組在加入VNP之前，用100 μg/L HS-142-1預處理15 min。迅速棄培養基，每個培養皿加入1 mL冰冷的三氯乙酸(0.24 mmol/L)，從培養皿刮取細胞。離心，去除沉淀析出的蛋白。1 mL無水乙醇清洗上清液3次。采用[125I]-cGMP放免測定試劑盒測定上清液中的cGMP水平，cGMP放免測定的敏感度為每管50 fmol。

6 Western blotting檢測β-微管蛋白III(β-tubulin III)的解聚

細胞用1 μmol/L MPP+處理24 h后，用洗脫液(2.0 g多聚甲醛、2.0 g NaOH、0.71 g Na2HPO4·12H2O、0.6 g NaH2PO4·2H2O、1.9 g EGTA、0.2 g MgCl2、0.1 mL Triton X-100溶于蒸餾水，定容50 mL，pH 7.0)洗脫，以去除解聚的β-tubulin III。含150 mmol/L NaCl的RIPA buffer裂解細胞，20 000×g離心10 min，獲取上清，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉移到PVDF膜(Immobilon P)。進行染色，I抗分別為抗小鼠β-tubulin III抗體(1 mg/L)和抗小鼠β-actin(40 μg/L, Santa Cruz)。II抗采用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記，化學發光法檢測(ECL Plus; Amersham Pharmacia)。

7 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 15.0分析。總體差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 VNP明顯減輕MPP+導致的DA神經元退行性病變

與對照組相比，MPP+明顯降低細胞活力(圖1)，并造成DA神經元減少(圖2)。MPP+(10 μmol/L)作用24 h可以使細胞活力降低52%，并且神經軸突的數目(圖3A)和長度(圖3B)也都顯著減少。而VNP能夠劑量依賴地抑制MPP+導致的DA神經元異常。VNP(10-7mol/L，本研究中用到的最高濃度)顯著增強暴露于MPP+的細胞活力(圖2A)，并使DA神經元的數量(圖2B)增加近50%，軸突數目(圖3A)增加70%，軸突長度(圖3B)增加30%。Western blotting分析發現，MPP+造成的β-tubulin Ⅲ解聚，可以被VNP部分逆轉(圖4)。

Figure 1. Effects of MPP+ on the viability of cultured neurons from mice.Mean±SD.n=4.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

Figure 2. Effects of VNP on the cultured neurons exposed to MPP+. A: the cell viability was determined by the means of MTT assay; B: the tyrosine hydroxylase-immunoreactive (TH-ir) neurons were photographed and counted under fluorescence microscopy (×400). Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs MPP+.

Figure 3. Effects of VNP on the number (A) and length (B) of cultured tyrosine hydroxylase-immunoreactive neurons exposed to MPP+. Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs MPP+ group.

Figure 4. Effects of VNP on the expression of polymerized β-tubulin Ⅲ in cultured neurons exposed to MPP+.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control and VNP+MPP+ group.

2 VNP激活cGMP/PKG信號通路

如圖5A所示，10-9～10-7mol/L VNP呈劑量依賴性地升高細胞內的cGMP水平，由(24±12)nmol/L升高至(183±44)nmol/L。HS-142-1 (100 μg/L)阻斷VNP(10-7mol/L)升高胞內cGMP的效應。

由于VNP造成胞內cGMP的堆積，我們接下來應用8-Br-cGMP(膜通透性的cGMP類似物)模擬VNP的效應。正如所料，8-Br-cGMP與VNP類似，也增加神經元的活力(圖5B)。進而，將HS-142-1和KT-5823(cGMP依賴性蛋白激酶的抑制劑)分別應用于PKG信號通路的關鍵點，發現VNP減弱MPP+神經毒性的效應可以被100 μg/L的HS-142-1或10-6mol/L KT-5823完全阻斷(圖5B)。

Figure 5. Effects of VNP on the cultured neurons were mimicked by 8-Br-cGMP, whereas blocked by HS-142-1 or KT5823. Mean±SD.n=4.**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs MPP+; △△P<0.01 vs VNP+MPP+.

討 論

本研究首次發現，已知的心血管肽VNP具有神經保護作用。我們的研究表明VNP減輕MPP+所致的神經損傷。類似的，我們以往在心血管系統的研究中發現，VNP減輕低氧導致的心血管系統損害[16-17]和肝纖維化[18]。這些結果表明，VNP對于血管、心臟和神經等多種組織具有廣泛的保護作用。

與血管平滑肌類似，神經系統中也存在cGMP信號通路。一些升高細胞內cGMP的物質，如NO、8-Br-cGMP具有抗神經元凋亡的作用[19]。在神經退行性病變中，存在環核苷酸磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterases，PDEs)導致的cGMP降解，以及PKG信號通路的異常[20]。本研究中VNP對于DA神經元的保護效應，也可能與其抗凋亡作用有關。

NPR-A(B)/cGMP/PKG途徑是VNP調控心血管系統的經典信號通路[16，21-22]。本研究也證明VNP的神經效應也依賴NPR-A(B)/cGMP/PKG途徑：首先，VNP增強細胞活力的效應可以被8-Br-cGMP所模擬，被KT-5823所阻斷。其次，HS-142-1可完全阻斷VNP的效應，提示VNP的神經效應是經鳥甘酸環化酶(guanylate cyclase，GC)偶聯的NPR介導的。但是，由于HS-142-1既能阻斷NPR-A也能阻斷NPR-B，所以從現有的數據我們尚不能確定是哪種GC偶聯的NPR(NRP-A或NPR-B)發揮作用，這是本研究的局限性之一。以往，Müller等[13]報道，在未成年腦組織，以NPR-B為主，在成年的腦組織NPR-A占優勢。從這個角度來說，在胎鼠神經元，VNP很可能是通過NPR-B發揮作用的。但這還需要直接的實驗證據。

作為一種人工設計合成的鈉尿肽，VNP不但擁有天然鈉尿肽如ANP、CNP的特性，而且還具有其親本分子不具有的特性。馮華松等[23]證明，VNP比ANP和CNP有更強大的擴張大鼠肺動脈和腹主動脈的效應。而且，VNP抑制肺動脈血管平滑肌增殖的效應也顯著強于ANP或CNP[16]。有理由推測，VNP的神經保護效應也可能強于天然的鈉尿肽。

[參 考 文 獻]

[1] Dauer W, Przedborski S. Parkinson’s disease: mechanisms and models [J]. Neuron, 2003, 39(6): 889-909.

[2] 周 婷，劉池波，徐小輝，等. 帕金森病相關血清蛋白質標志物的篩選及鑒定[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(4): 664-669.

[3] Antenor-Dorsey JA, O’Malley KL.WldSbut not Nmnat1 protects dopaminergic neurites from MPP+neurotoxicity [J]. Mol Neurodegener, 2012, 7: 5.

[4] Ren Y, Liu W, Jiang H, et al. Selective vulnerability of dopaminergic neurons to microtubule depolymerization [J]. J Biol Chem, 2005, 280(40): 34105-34112.

[5] Cappelletti G, Pedrotti B, Maggioni MG, et al. Microtubule assembly is directly affected by MPP+invitro[J]. Cell Biol Int, 2001, 25(10): 981-984.

[6] Cartelli D, Ronchi C, Maggioni MG, et al. Microtubule dysfunction precedes transport impairment and mitochondria damage in MPP+-induced neurodegeneration [J]. J Neurochem, 2010, 115(1): 247-258.

[7] Morfini G, Pigino G, Opalach K, et al. 1-Methyl-4-phenylpyridinium affects fast axonal transport by activation of caspase and protein kinase C [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(7): 2442-2447.

[8] Kim-Han JS, Antenor-Dorsey JA, O’Malley KL. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons [J]. J Neurosci, 2011, 31(19): 7212-7221.

[9] 于立明，閆文俊，邢文娟，等. 長期胰島素治療通過促進BNP表達延緩缺血性心力衰竭的發展及其機制 [J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(9): 1554-1560.

[10] Wei CM, Kim CH, Miller VM, et al. Vasonatrin peptide: a unique synthetic natriuretic and vasorelaxing peptide [J]. J Clin Invest, 1993, 92(4): 2048-2052.

[11] Morishita Y, Sano T, Ando K, et al. Microbial polysaccharide, HS-142-1, competitively and selectively inhibits ANP binding to its guanylyl cyclase-containing receptor [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1991, 176(3): 949-957.

[12] Nakatsuji H, Maeda N, Hibuse T, et al. Reciprocal regulation of natriuretic peptide receptors by insulin in adipose cells [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 392(1): 100-105.

[13] Müller D, Hida B, Guidone G, et al. Expression of guanylyl cyclase (GC)-A and GC-B during brain development: evidence for a role of GC-B in perinatal neurogenesis [J]. Endocrinology, 2009, 150(12): 5520-5529.

[14] Zhang W, Qin L, Wang T, et al. 3-hydroxymorphinan is neurotrophic to dopaminergic neurons and is also neuroprotective against LPS-induced neurotoxicity [J]. FASEB J, 2005, 19(3): 395-397.

[15] Krieglstein K, Suter-Crazzolara C, Fischer WH, et al. TGF-beta superfamily members promote survival of midbrain dopaminergic neurons and protect them against MPP+toxicity [J]. EMBO J, 1995, 14(4): 736-742.

[16] 徐娜娜，黃山英，柳子墨，等.鈉尿肽C型受體信號通路與心血管疾病[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(12): 2417-2422.

[17] Yu J, Feng HS, Chen BY, et al. Protective effects of vasonatrin peptide against hypobaric hypoxia-induced pulmonary hypertension in rats [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 37(1): 69-74.

[18] Chen BY, Qu P, Tie R, et al. Protecting effects of vasonatrin peptide against carbon tetrachloride-induced liver fibrosis [J]. Regul Pept, 2010, 164(2-3): 139-143.

[19] Fiscus RR. Involvement of cyclic GMP and protein kinase G in the regulation of apoptosis and survival in neural cells [J]. Neurosignals, 2002, 11(4): 175-190.

[20] Bollen E, Prickaerts J. Phosphodiesterases in neurodegenerative disorders [J]. IUBMB Life, 2012, 64(12): 965-970.

[21] Lu SY, Zhu MZ, Wang DS, et al. Inhibition of the proliferation of smooth muscle cells from human coronary bypass vessels by vasonatrin peptide [J]. Physiol Res, 2004, 53(4): 387-393.

[22] Yu J, Zhu M, Fu Z, et al. Vasorelaxing action of vasonatrin peptide is associated with activation of large-conductance Ca2+-activated potassium channels in vascular smooth muscle cells [J]. Physiol Res, 2010, 59(2): 187-194.

[23] 馮華松, 臧益民, 朱妙章, 等. 血管鈉肽、C型鈉尿肽和心房鈉尿肽舒血管作用的對比[J]. 生理學報, 1999, 51(5): 515-520.