慢病毒介導的GOLPH3基因沉默對人胃癌SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響*

蘇 婷， 賴銘裕， 農云翠

(廣西醫科大學第一附屬醫院 1消化內科， 2老年消化內科，廣西 南寧 530021)

高爾基體磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)，又名GMx33或GPP34，是新近發現的一個癌蛋白，定位于反面高爾基體網管狀結構(trans-Golgi network，TGN)，可誘導正常細胞發生轉化，促使細胞增殖和分化過程失去平衡，最終導致細胞惡性轉化以及腫瘤的發生。2009年，Scott等[1]的研究發現肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌等多種實體腫瘤中均存在5p13區域拷貝頻率的異常增加，對此區域進行系統性分析后發現GOLPH3基因的表達與5p13區域的拷貝狀態關系密切，并通過體內、體外等實驗首次證實了GOLPH3是一個新的致癌基因。目前國內外關于GOLPH3與人類腫瘤發生的研究，如橫紋肌肉瘤[2]、舌癌[3]、食管癌[4]、神經膠質細胞瘤[5]等，均有報道；其中，Hu 等[6]首次對GOLPH3與胃癌組織的關系進行了研究，結果發現GOLPH3在胃癌組織中的表達高于正常組織，提示GOLPH3可能是胃癌預后不良的預測因子。然而，抑制GOLPH3是否會對胃癌細胞的生長產生影響尚未清楚。本研究利用慢病毒介導的GOLPH3沉默載體(LV-GOLPH3-RNAi)轉染至人胃癌SGC-7901細胞，構建GOLPH3沉默的穩轉細胞株，并觀察沉默GOLPH3基因對SGC-7901細胞生物學行為的影響，為臨床上胃癌的診治及預后奠定實驗基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901(中國科學院上海細胞庫)；RPMI-1640培養基(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青)；LV-GOLPH3-RNAi、scrambled序列及轉染試劑(上海吉凱基因)；Trizol(Invitrogen)；RNA逆轉錄試劑盒、GOLPH3、β-actin引物和PCR擴增試劑盒(大連寶生物)；GOLPH3兔抗人多克隆抗體(Abcam)；β-actin抗體(上海康成)；山羊抗兔IgG Ⅱ抗(北京金橋)；MTT試劑(Solarbio)；Transwell小室(Corning)。

2 方法

2.1細胞培養 將復蘇的SGC-7901細胞置于事先準備好的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行常規的培養和傳代。

2.2慢病毒LV-GOLPH3-RNAi轉染，建立穩定感染LV-GOLPH3-RNAi的SGC-7901細胞 轉染前24 h，選取生長狀態良好的SGC-7901細胞按(3～5)×105cells/well接種于6孔板中，培養24 h后，細胞融合率達到70%～90%時，根據預實驗結果，選取含有干擾GOLPH3效果最佳的靶點序列(5’-TTCTTGACAAATGGGTGAA-3’)以及陰性對照組的scramble序列的病毒液按照慢病毒轉染手冊轉染至SGC-7901細胞中，制備成穩定感染LV-GOLPH3-RNAi的SGC-7901細胞及陰性對照細胞；并收集同期未轉染的SGC-7901細胞設為空白對照組。轉染后12 h觀察細胞狀態，若無明顯的細胞毒性作用，可48 h后更換為常規培養基；若有明顯的細胞毒作用則12 h后立即更換為常規培養基。轉染后72 h在倒置相差熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光的SGC-7901細胞，轉染效率(同一個視野，熒光顯微鏡下熒光細胞個數/光學顯微鏡下細胞個數)大于80%，則可進行擴大培養，用于后續實驗。

2.3Real-time PCR檢測GOLPH3 mRNA的表達 收集各個實驗組(LV-GOLPH3-RNAi組、scrambled組和空白對照組)對數生長期的細胞，用Trizol法進行總RNA的提取，按照逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。取逆轉錄產物2 μL，總體系20 μL，以SYBR Green染料法進行實時熒光定量PCR反應，β-actin為內參照。利用Primer 5設計引物序列如下：GOLPH3 上游引物5’-ATCTGGATTACGTGGCTGTATGTTA-3’，下游引物5’-CGTTTCTGGAGGCTGAGTTTC-3’，產物大小為187 bp；內參照β-actin上游引物5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’， 產物大小為186 bp。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

2.4Western blotting檢測GOLPH3蛋白的表達 收集各實驗組細胞，加入RIPA及PMSF提取總蛋白液，將總蛋白液與上樣緩沖液按5∶1的比例混合，經變性后制成蛋白質樣品。配制5%濃縮膠和10%分離膠，將蛋白質樣品加入孔道，進行SDS-PAGE電泳，電泳產物以100 mA恒流電轉至PVDF膜，用5%蛋白封閉液室溫于搖床上搖動封閉1 h，用TBST漂洗后置于稀釋的Ⅰ抗(GOLPH3：1∶1 000；β-actin: 1∶10 000)中4 ℃孵育過夜，再次TBST漂洗后加入稀釋的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫置于搖床上孵育1 h，洗膜后進行顯影、定影。以β-actin為內參照，用圖像處理軟件ImageJ對蛋白的條帶進行半定量分析。

2.5MTT法檢測各組細胞增殖力 收集各實驗組處于對數生長期的細胞，調整細胞懸液濃度至5×103cells/well (100 μL)接種于96孔板中，每塊96孔板均設LV-GOLPH3-RNAi組、scrambled組和空白對照組，每組設5個復孔，于接種后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h在培養基中加入20 μL MTT溶液，使MTT終濃度為0.5 g/L，于培養箱中繼續培養4 h后棄液，加入等體積DMSO，搖床振蕩10 min使結晶物完全溶解后，在酶聯免疫檢測儀用492 nm波長測各孔吸光度值，并繪制細胞生長曲線。

2.6Transwell實驗檢測GOLPH3沉默對SGC-7901細胞侵襲和遷移的影響 在Transwell侵襲實驗中，按1∶8比例將Matrigel稀釋于無血清培養基中，取上述稀釋液30～50 μL加入Transwell上室使其覆蓋整個聚碳脂膜上表面，于37 ℃培養箱中靜置30 min ，使Matrigel凝結成膠。下室加入600 μL含15%胎牛血清的培養基，上室則加入制備好的細胞懸液200 μL(3×108/L)。常規培養24 h后取出Transwell小室，用棉簽小心擦去上室聚碳脂膜表面未穿過的細胞，甲醛固定小室20 min后用0.1%結晶紫染色15 min，PBS沖洗晾干。將小室的下表面置于光學顯微鏡下進行觀察，隨機選取5個視野(上、中、下、左、右)進行計數并統計分析。遷移實驗無需加入Matrigel包被Transwell上室聚碳脂膜，其余步驟與侵襲實驗相同。每個實驗組均重復3次。

3 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件包分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 慢病毒高效轉染SGC-7901細胞建立穩定轉染細胞系

將LV-GOLPH3-RNAi和scrambled組的慢病毒顆粒轉染至人胃癌細胞株SGC-7901并培養72 h后，于倒置相差熒光顯微鏡下觀察轉染效果，可見表達綠色熒光蛋白的細胞比例達80%以上，提示慢病毒轉染成功并穩定表達，可繼續后續實驗，見圖1。

2 慢病毒轉染LV-GOLPH3-RNAi降低SGC-7901細胞GOLPH3 mRNA的表達

將LV-GOLPH3-RNAi和scrambled組的慢病毒顆粒轉染至SGC-7901細胞，以β-actin為內參照，LV-GOLPH3-RNAi組、scrambled組和空白對照組GOLPH3 mRNA的相對表達量分別為0.28±0.04、1.62±0.11和1.66±0.19；LV-GOLPH3-RNAi組GOLPH3 mRNA的表達均低于scrambled組和空白對照組(P<0.05)，其表達量分別為上述2個對照組的17.28%和16.87%，干擾效率為82.72%和83.13%；而scrambled組和空白對照組的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 2. Relative mRNA expression of GOLPH3.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

3 慢病毒轉染LV-GOLPH3-RNAi降低SGC-7901細胞GOLPH3蛋白的表達

與scrambled組和空白對照組對比，LV-GOLPH3-RNAi組的GOLPH3蛋白條帶減弱，GOLPH3蛋白表達降低，差異有統計學意義(0.99±0.01、0.98±0.03和0.36±0.09，P<0.05)，LV-GOLPH3-RNAi組的GOLPH3蛋白表達量降低了63.63%和63.26%，scrambled組和空白對照組的差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

4 慢病毒轉染LV-GOLPH3-RNAi抑制SGC-7901細胞的增殖力

根據MTT結果繪制各實驗組生長曲線見圖4，可見LV-GOLPH3-RNAi組SGC-7901細胞的增殖較scrambled組和空白對照組緩慢，并且該作用隨著時間的增加而更為明顯，觀察至第5天，LV-GOLPH3-RNAi組的A值顯著低于scrambled組和空白對照組(P<0.05)，其它各組比較差異無統計學意義。

Figure 3. The protein expression of GOLPH3.Mean±SD.n=3.1: scrambled group; 2: blank control group; 3: LV-GOLPH3-RNAi group.*P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

Figure 4. The effect of GOLPH3 silencing on the cell proliferation.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

5 慢病毒轉染LV-GOLPH3-RNAi抑制SGC-7901細胞侵襲和遷移能力

侵襲實驗中，可見LV-GOLPH3-RNAi組穿過上室Matrigel和聚碳脂膜微孔的細胞數(33.5±3.0)低于scrambled組(85.0±3.9)和空白對照組(83.1±4.4;P<0.05)；遷移實驗中，LV-GOLPH3-RNAi組穿過上室聚碳脂膜微孔的細胞數(56.7±1.5)低于scrambled組(186.0±3.4)和空白對照組(183.3±4.2；P<0.05)。侵襲和遷移實驗中，scrambled組和空白對照組的差異無統計學意義，見圖5。

Figure 5. Invasion assay (A) and migration assay (B).Magnification:×200.

討 論

GOLPH3是由5p13區域基因編碼的一種高度保守的蛋白，相對分子量約30 kD，由Wu等[7]于2000年首次在小鼠高爾基體中檢測到，并參與保持高爾基體正常形態、蛋白質的加工和運輸。Scott等[1]通過對5p13區域的研究發現GOLPH3有可能是腫瘤發生發展的一個重要因素，是一個新的致癌基因，能通過激活mTOR信號通路促進細胞的轉化和腫瘤的生長，并增加腫瘤細胞對雷帕霉素的敏感性[8-9]。近年來的研究發現GOLPH3在多種腫瘤組織中高表達，已有證據[6]表明人類胃癌中也有GOLPH3的高表達，并且其高表達與預后不良相關。但GOLPH3與胃癌的遷移、侵襲能力的研究鮮見報道，為此我們進行了這一體外實驗，探討下調GOLPH3表達水平對胃癌細胞遷移、侵襲能力的影響。

我國是胃癌高發的地區之一，雖然近年來發病率有所下降[10]，但因胃癌早期診出率較低，其病死率并未下降。胃癌是多步驟、多因素共同作用所致發展，其形成與致癌基因的激活、抑癌基因的失活等密切相關。特異性地阻斷胃癌中致癌基因的表達有可能抑制胃癌的發生發展。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是利用外源性或內源性的短雙鏈RNA抑制細胞內特定基因的表達的一種技術，具有高效性、特異性和低毒性，目前廣泛應用于惡性腫瘤、病毒感染性疾病等的研究[11]。應用慢病毒載體介導RNAi所致的基因沉默具有持久性和穩定性，并且無病毒蛋白的表達[12]，該技術在促進基因組學研究的進一步發展有重要作用。

本實驗將載有GOLPH3干擾序列的慢病毒LV-GOLPH3-RNAi轉染至SGC7901細胞，并檢測到GOLPH3 mRNA和GOLPH3蛋白在LV-GOLPH3-RNAi組細胞中的表達水平明顯下降，而在空白對照組和scrambled組中的表達差異無統計學意義，說明該載體能有效沉默GOLPH3，穩定沉默GOLPH3的細胞株構建成功，也證實了慢病毒介導的基因沉默技術具有穩定、持久的優勢，是基因治療的有力工具。后續實驗中，我們發現下調GOLPH3的表達水平使得SGC7901細胞的增殖力減慢，而Zeng等[13]學者則報道了GOLPH3的過表達促進乳腺癌細胞的增殖，并與其較低的生存率相關，這說明了GOLPH3的水平與腫瘤細胞的增殖有極大的關系，與腫瘤早期的形成相關。在細胞遷移和侵襲實驗中，我們發現LV-GOLPH3-RNAi組SGC-7901細胞的遷移和侵襲能力明顯低于對照組，這與GOLPH3水平和神經膠質細胞瘤的研究結果一致：下調GOLPH3的表達水平可明顯降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力[5]，說明GOLPH3在惡性腫瘤晚期的侵襲和轉移中扮演重要角色。Scott等[1]的研究提示GOLPH3的作用與mTOR信號通路相關，而PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路參與調控包括胃癌在內的多種腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移[14]，有研究[15]表明PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502可抑制胃癌細胞的增殖和凋亡；但GOLPH3如何靶定該信號轉導通路相關的分子來介導胃癌的侵襲、轉移，目前尚未清楚，仍需更進一步的研究。

綜上所述，本實驗利用慢病毒載體將LV-GOLPH3-RNAi轉染胃癌SGC-7901細胞，產生特異性的GOLPH3沉默效應，抑制了胃癌SGC-7901細胞的增殖，遷移和侵襲能力，該結果說明GOLPH3有可能參與胃癌早期的形成以及晚期的的侵襲、轉移等行為，提示GOLPH3可作為潛在的腫瘤標記物及獨立的預后因子。

[參 考 文 獻]

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