流蘇石斛組培快繁與煉苗移栽

羅鳴+劉海+李娟+吳明開+

摘要：以流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）為試料，研究了種子萌發形成原球莖，原球莖的增殖培養、器官分化，建立了快速繁殖體系，經過初代培養、繼代培養，成功培育出再生植株，并對組培苗的大棚移栽馴化等方面進行研究，初步形成從組培快繁到大棚生產的一系列培育過程，為流蘇石斛的規模化生產發展奠定基礎。

關鍵詞：流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）；無菌萌發；組織培養；煉苗馴化

中圖分類號：S603.6文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）08－1930-03

Tissue Culture and Traininｇ Ｐｌａｎｔｌｅｔ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ Ｈｏｏｋ．

ＬＵＯ Ｍｉｎｇ１，２，３，ＬＩＵ Ｈａｉ１，２，３，ＬＩ Ｊｕａｎ２，ＷＵ Ｍｉｎｇ－ｋａｉ２，３

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００１， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｍｏｄｅｒｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００６， Ｃｈｉｎａ；

３． Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， rｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｂｕｌｂｓ， ｃｏｒｍｓ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｏｒｇａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， ｉｎｉｔｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ． Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ. A ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｆｏｓｔｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ and ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ were ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｆｏｒｍｅｄ. It will ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ Ｈｏｏｋ．； ａｓｅｐｔｉｃ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｔｒａｉｎｉｎｇ ｐｌａｎｔｌｅｔ

流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）又名馬鞭石斛，為蘭科石斛屬附生植物，具有很高的藥用價值，是收載于《中國藥典》石斛的原植物之一［1］，其花非常艷麗，具有較高的觀賞價值。現代藥理研究表明石斛具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用。在治療惡性腫瘤、胃腸道疾病、糖尿病、白內障、關節炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等疾病具有很好的療效［2-4］。近年來，隨著市場需求量不斷增加，野生資源被過度采挖，加上其自身繁殖特性以及對生長環境的特殊要求，流蘇石斛野生資源瀕臨枯竭［5］。人工培育是解決珍稀瀕危藥用植物資源保護與滿足市場需求矛盾的一種有效手段。流蘇石斛輔以人工授粉可以獲得大量種子，一個蒴果含有幾萬到十幾萬粒種子，但石斛種子自然萌發率極低，進行種子無菌萌發能獲得大量組培苗［6-8］。目前種子無菌萌發技術較為成熟，但組培苗煉苗移栽技術不夠成熟，缺乏大量健壯優質種苗成為制約流蘇石斛進行規模化生產發展的技術瓶頸，本研究為獲得健壯優質種苗及幼苗的批量生產奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

流蘇石斛收集于云南省文山壯族苗族自治州，保存于貴州省農業科學院蘭科植物活體保存圃中。

1.2培養基

初代培養基：1/2 MＳ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ，添加２５ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ瓊脂，ｐＨ ５．８。

繼代培養基：１／２ ＭＳ＋ ０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ，添加２５ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ瓊脂，２００ ｇ／Ｌ馬鈴薯泥，ｐＨ ５．８。

壯苗生根培養基：改良培養基（ＷＭ）［９］＋２．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ瓊脂、１００ ｇ／Ｌ香蕉汁，ｐＨ ５．６。

1.3流蘇石斛無菌播種

流蘇石斛開花后進行人工授粉結實，采集后將蒴果在流水下沖洗干凈，用吸水紙吸干水分，置于超凈工作臺上。用75%乙醇擦拭表皮2次，然后用0.1%的升汞浸泡10 min，用無菌水沖洗5次，用吸水紙吸干表面的水分，用滅菌后的醫用脫脂棉包裹后，放置于4 ℃下保存。取出保存的蒴果進行播種，在無菌條件下，用解剖刀切開蒴果，將種子撒到培養基內。溫度為（24±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度2 000 lx，濕度30%~50%。

1.4流蘇石斛組培苗煉苗移栽

移栽前先將瓶苗放置大棚內先煉苗5 d，讓瓶苗從封閉穩定的環境向開放變化的環境過渡，慢慢適應自然環境。以生長健壯、葉色正常，肉質莖有3~4個節間、4~5片葉，4~5條根（長3 cm以上），根皮色白中帶綠、無黑色根、無畸形、無變異的苗為試驗材料。

組培苗出瓶時，將培養基與組培苗一起輕輕取出，放置于盆中待清洗，污染苗、裸根苗或少根苗分別放置。特別要洗凈培養基，以免剩余培養基發霉引起爛根，再換自來水清洗1~2次。污染苗經過清洗后，用1 000倍多菌靈浸泡整株小苗10 min，以控制污染。

將所有流蘇石斛組培苗按莖長分為大（>6 cm）、中（4~6 cm）、小（<4 cm）3個等級（圖3），每個等級選取30株長勢相同的組培苗。將其栽種于樹皮（2~3 cm）和細鋸末的等量混合的培養基質中，選取優質種苗后，進行不同基質處理的煉苗試驗，統計莖粗平均生長量和莖粗增長率。

處理Ⅰ：長度2~3 cm的樹皮和細鋸末的等量混合；處理Ⅱ：長度2~3 cm的樹皮和直徑1 cm的陶土等量混合；處理Ⅲ：蘭花土和直徑1 cm的陶土等量混合。

2結果與分析

2.1流蘇石斛組培育苗結果

由圖1可以看出，種子在播種初代培養基10 d后開始萌發；20 d后可以觀察到流蘇石斛種子由黃綠色變為綠色小圓球；40 d后綠色圓球發育出葉尖；60 d后綠色圓球進一步發育；80 d左右經過大部分發育生長出2片幼葉，同時原球莖大量增殖，這時為了保障組培苗的營養供應與充分發育，應及時進行轉接培養，接種繼代培養基。轉接后的流蘇石斛組培苗放置于溫度為（22±2）℃、光照時間12 h/d、光照度2 000 lx、濕度30%~50%的培養室中培養，2~3個月后再進行轉接培養，組培苗分蘗增殖，普遍形成叢苗，長勢良好；在利用改良培養基進行壯苗生根培養，可以獲得大量出瓶煉苗馴化移栽，根系發達的壯苗。

2.2流蘇石斛組培苗煉苗移栽結果

煉苗處理100 d后對流蘇石斛組培幼苗進行統計。小于4 cm的組培苗成活率為90.0%，4~6 cm的組培苗成活率為86.7%，大于6 cm的組培苗成活率最高為96.7%。然后以莖粗每隔25 d的平均生長量為依據，統計分析3種基質中30株莖長大于6 cm的流蘇石斛幼苗的平均莖粗（表1）。煉苗馴化25 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為63.70%；煉苗馴化50 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為133.09%；但馴化75 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率最大為203.59%，高于處理Ⅱ、Ⅲ的平均莖粗增長率；并且在100 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率達到208.01%，生長優勢更為明顯。

3小結與討論

流蘇石斛種子無菌萌發適宜培養基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂，pH 5.8，種子萌發快，萌發率高；繼代培養適宜培養基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，200 g/L馬鈴薯泥，pH 5.8，組培苗生長旺盛；壯苗生根適宜培養基為改良培養基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壯、根系發達。

流蘇石斛作為中藥材，既可以全株入藥，也可以新鮮莖入藥，因此莖粗、株高、新根數等都是衡量產量的重要指標。根據各個基質處理的莖粗信息，處理Ⅰ中的組培苗在生長過程中莖較粗，更能促進流蘇石斛的生長發育，其特點是鋸末比例較高，基質通透性和保水保肥性比較好，更適合鐵皮石斛生長［10］。處理Ⅱ保水保肥性能較差，不適合流蘇石斛的生長。處理Ⅲ由于使用蘭花土導致基質通透性變差，也不太適合流蘇石斛的生長。

參考文獻：

［１］國家藥典委員會． 中華人民共和國藥典［Ｍ］．北京：中國醫藥科學技術出版社，２０１０．

［２］高學敏．中藥學［Ｍ］．北京：中國中醫藥出版社， ２００２．５５３．

［３］ 王憲楷，趙同芳．石斛屬植物的化學成分與中藥石斛［Ｊ］．中國藥學雜志，１９８６，２１（１１）：６６６-669．

［４］王康正，高文遠．石斛屬藥用植物研究進展［Ｊ］．中草藥，１９９７， ２８（１０）：６３３-635．

［５］劉強，殷壽華，黃文，等．流蘇石斛瀕危原因及資源保護［Ｊ］．亞熱帶植物科學，２００７，３６（４）：４５－４７．

［６］ 黃勇．流蘇石斛組織培養體系研究［Ｊ］．安徽農業科學，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余樂，蘭芹英，湯庚國．流蘇石斛種子非共生萌發的研究［Ｊ］． 福建林學院學報，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黃衛昌，殷麗青，胡永紅，等．流蘇石斛的離體快速繁殖［Ｊ］．上海交通大學學報（農業科學版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吳明開，朱國勝，毛堂芬，等．正交試驗優選環草石斛組培苗壯苗生產工藝［Ｊ］． 激光生物學報，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益紅，孫紅杰，史冀清．蘇州地區鐵皮石斛移栽基質優化篩選研究［Ｊ］． 安徽農業科學，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（責任編輯 屠晶）

2.2流蘇石斛組培苗煉苗移栽結果

煉苗處理100 d后對流蘇石斛組培幼苗進行統計。小于4 cm的組培苗成活率為90.0%，4~6 cm的組培苗成活率為86.7%，大于6 cm的組培苗成活率最高為96.7%。然后以莖粗每隔25 d的平均生長量為依據，統計分析3種基質中30株莖長大于6 cm的流蘇石斛幼苗的平均莖粗（表1）。煉苗馴化25 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為63.70%；煉苗馴化50 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為133.09%；但馴化75 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率最大為203.59%，高于處理Ⅱ、Ⅲ的平均莖粗增長率；并且在100 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率達到208.01%，生長優勢更為明顯。

3小結與討論

流蘇石斛種子無菌萌發適宜培養基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂，pH 5.8，種子萌發快，萌發率高；繼代培養適宜培養基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，200 g/L馬鈴薯泥，pH 5.8，組培苗生長旺盛；壯苗生根適宜培養基為改良培養基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壯、根系發達。

流蘇石斛作為中藥材，既可以全株入藥，也可以新鮮莖入藥，因此莖粗、株高、新根數等都是衡量產量的重要指標。根據各個基質處理的莖粗信息，處理Ⅰ中的組培苗在生長過程中莖較粗，更能促進流蘇石斛的生長發育，其特點是鋸末比例較高，基質通透性和保水保肥性比較好，更適合鐵皮石斛生長［10］。處理Ⅱ保水保肥性能較差，不適合流蘇石斛的生長。處理Ⅲ由于使用蘭花土導致基質通透性變差，也不太適合流蘇石斛的生長。

參考文獻：

［１］國家藥典委員會． 中華人民共和國藥典［Ｍ］．北京：中國醫藥科學技術出版社，２０１０．

［２］高學敏．中藥學［Ｍ］．北京：中國中醫藥出版社， ２００２．５５３．

［３］ 王憲楷，趙同芳．石斛屬植物的化學成分與中藥石斛［Ｊ］．中國藥學雜志，１９８６，２１（１１）：６６６-669．

［４］王康正，高文遠．石斛屬藥用植物研究進展［Ｊ］．中草藥，１９９７， ２８（１０）：６３３-635．

［５］劉強，殷壽華，黃文，等．流蘇石斛瀕危原因及資源保護［Ｊ］．亞熱帶植物科學，２００７，３６（４）：４５－４７．

［６］ 黃勇．流蘇石斛組織培養體系研究［Ｊ］．安徽農業科學，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余樂，蘭芹英，湯庚國．流蘇石斛種子非共生萌發的研究［Ｊ］． 福建林學院學報，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黃衛昌，殷麗青，胡永紅，等．流蘇石斛的離體快速繁殖［Ｊ］．上海交通大學學報（農業科學版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吳明開，朱國勝，毛堂芬，等．正交試驗優選環草石斛組培苗壯苗生產工藝［Ｊ］． 激光生物學報，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益紅，孫紅杰，史冀清．蘇州地區鐵皮石斛移栽基質優化篩選研究［Ｊ］． 安徽農業科學，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（責任編輯 屠晶）

2.2流蘇石斛組培苗煉苗移栽結果

煉苗處理100 d后對流蘇石斛組培幼苗進行統計。小于4 cm的組培苗成活率為90.0%，4~6 cm的組培苗成活率為86.7%，大于6 cm的組培苗成活率最高為96.7%。然后以莖粗每隔25 d的平均生長量為依據，統計分析3種基質中30株莖長大于6 cm的流蘇石斛幼苗的平均莖粗（表1）。煉苗馴化25 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為63.70%；煉苗馴化50 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為133.09%；但馴化75 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率最大為203.59%，高于處理Ⅱ、Ⅲ的平均莖粗增長率；并且在100 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率達到208.01%，生長優勢更為明顯。

3小結與討論

流蘇石斛種子無菌萌發適宜培養基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂，pH 5.8，種子萌發快，萌發率高；繼代培養適宜培養基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，200 g/L馬鈴薯泥，pH 5.8，組培苗生長旺盛；壯苗生根適宜培養基為改良培養基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壯、根系發達。

流蘇石斛作為中藥材，既可以全株入藥，也可以新鮮莖入藥，因此莖粗、株高、新根數等都是衡量產量的重要指標。根據各個基質處理的莖粗信息，處理Ⅰ中的組培苗在生長過程中莖較粗，更能促進流蘇石斛的生長發育，其特點是鋸末比例較高，基質通透性和保水保肥性比較好，更適合鐵皮石斛生長［10］。處理Ⅱ保水保肥性能較差，不適合流蘇石斛的生長。處理Ⅲ由于使用蘭花土導致基質通透性變差，也不太適合流蘇石斛的生長。

參考文獻：

［１］國家藥典委員會． 中華人民共和國藥典［Ｍ］．北京：中國醫藥科學技術出版社，２０１０．

［２］高學敏．中藥學［Ｍ］．北京：中國中醫藥出版社， ２００２．５５３．

［３］ 王憲楷，趙同芳．石斛屬植物的化學成分與中藥石斛［Ｊ］．中國藥學雜志，１９８６，２１（１１）：６６６-669．

［４］王康正，高文遠．石斛屬藥用植物研究進展［Ｊ］．中草藥，１９９７， ２８（１０）：６３３-635．

［５］劉強，殷壽華，黃文，等．流蘇石斛瀕危原因及資源保護［Ｊ］．亞熱帶植物科學，２００７，３６（４）：４５－４７．

［６］ 黃勇．流蘇石斛組織培養體系研究［Ｊ］．安徽農業科學，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余樂，蘭芹英，湯庚國．流蘇石斛種子非共生萌發的研究［Ｊ］． 福建林學院學報，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黃衛昌，殷麗青，胡永紅，等．流蘇石斛的離體快速繁殖［Ｊ］．上海交通大學學報（農業科學版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吳明開，朱國勝，毛堂芬，等．正交試驗優選環草石斛組培苗壯苗生產工藝［Ｊ］． 激光生物學報，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益紅，孫紅杰，史冀清．蘇州地區鐵皮石斛移栽基質優化篩選研究［Ｊ］． 安徽農業科學，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（責任編輯 屠晶）