產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的篩選鑒定及酶學性質

陳希+王淑芬+王天賜+吳華偉

摘要：利用環糊精葡萄糖基轉移酶（ＣＧＴａｓｅ）快速篩選法從枝江酒業的酵泥中篩選獲得１１株ＣＧＴａｓｅ產生菌。用酚酞法測定所得１１株菌株的酶活，最終得到β－ＣＧＴａｓｅ酶活最高的一株菌株，命名為Ｈｈｊ－１。通過對菌株的形態觀察以及１６Ｓ ｒＤＮＡ測定，并建立該菌株的系統發育樹，確定該菌株屬于坎皮納斯類芽孢桿菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）。對該菌所產的β－ＣＧＴａｓｅ粗酶液酶學性質進行研究，結果表明，該酶的最適反應溫度為７０ ℃，最適反應ｐＨ為７．５。在３５～４５ ℃保溫１ ｈ相對酶活仍可保持在９０％以上，且該酶在ｐＨ ５．０～１０．０的較寬范圍內都較穩定，說明其對ｐＨ適應范圍較廣，因此應用有較大的靈活性。

關鍵詞：β－環糊精葡萄糖基轉移酶；鑒定；坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）；酶學性質

中圖分類號：ＴＳ２０１．２５文獻標識碼：Ａ文章編號：０４３９－８１１４（２０１４）０８－1891－０4

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｔｒａｉｎ

ＣＨＥＮ Ｘｉ，ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｆｅｎ，ＷＡＮＧ Ｔｉａｎ－ｃｉ，ＷＵ Ｈｕａ－ｗｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ， Cｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Using rapid screening methoｄ， １１ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴａｓｅ） ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｍｕｄ ｏｆ ＺｈｉＪｉａｎｇ ｌｉｑｕｏｒ， Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｓｅ １１ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｈｅｎｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｎａｍｅｄ Ｈｈｊ－１． Ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｅｎｃｅｓ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ β－ＣＧＴａｓｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ β－ＣＧＴａｓｅ ｗａｓ ７０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐＨ ｗａｓ ７．５． Ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ９０％ ｏｆ ｉｔｓ ｉｎｉｔｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ １ ｈｏｕｒ ａｔ ３５～４５ ℃． Ｉｔ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐＨ ５．０－１０．０， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ａ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉs； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ

環糊精（cyclodextrin，簡稱CD）是由D-吡喃葡萄糖基以α-1，4-葡萄糖苷鍵連接成的環狀低聚糖。根據組成葡萄糖基個數的不同，將環糊精分為α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精（葡萄糖基個數分別為6、7、8個）。3種環糊精中β-環糊精的溶解度最小，容易結晶析出，因此它便于生產。環糊精可將許多疏水性化學物質包結在其獨特的環形疏水空隙內，改善其理化性質，在制藥、食品、農業及化妝品等領域應用廣泛［1，2］。

環糊精葡萄糖基轉移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase， EC 2. 4. 1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族的重要成員，催化淀粉合成環糊精，它通過環化作用、耦合作用、歧化作用、水解作用來催化環糊精的生成反應。環糊精的工業化生產均采用酶法合成， 在環糊精研究的早期，由于沒有篩選出高效生產CGTase的菌株而導致環糊精的生產效率很低， 環糊精的應用受到很大限制。可以產CGTase的微生物主要是芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物，包括嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilis）、耐堿性巨大芽孢桿菌（B. megateruim）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、環化芽孢桿菌（B. circulans）等［3］。為實現β-CD的低成本工業化生產，篩選出具有產較高活性β-CGTase的菌株是關鍵，并為后續發掘優秀的基因資源，利用基因工程大量生產CGTase奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣本新鮮土樣取自湖北省枝江酒業發酵窖泥中。

1.1.2培養基平板篩選培養基：1 000 mL培養基中，可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO4 1 g， MgSO4 0.098 g，Na2CO3 5 g，酚酞0.3 g，甲基橙0.1 g，瓊脂15 g；發酵培養基：1 000 mL培養基中，可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 0.098 g，Na2CO3 5 g。

1.2試驗方法

1.2.1β-CGTase產生菌的篩選①初篩。取5 g土樣放入裝有45 mL去離子水及玻璃珠的250 mL三角瓶中，80 ℃水浴處理5 min，靜置30 min，取上清液稀釋后涂布于篩選平板培養基上，于37 ℃恒溫培養箱培養2~3 d。挑取四周出現較大黃色透明圈的菌落進一步劃線純化。②復篩。 挑取平板上的單菌落，放在裝有5 mL液體培養基的試管中，37 ℃，180 r/min擴大培養一夜，再取10%的菌落放在裝有50 mL發酵培養基中，30℃，230 r/min培養48 h。將發酵液于4 000 r/min離心20 min，得到粗酶液，進行酶活測定，挑取酶活性較高的菌株進行保藏。以酶活最高的菌株作進一步研究的出發菌株。

1.2.2β-CGTase產生菌的鑒定①形態鑒定。取保藏的菌株在篩選培養基上劃線，37 ℃培養2~3 d，觀察菌落形狀、大小、表面光滑度、菌落及培養基顏色，并且取菌落涂片，進行革蘭氏染色。②分子鑒定。提取菌株基因組總DNA［4，5］，用細菌通用引物: 上游引物27F（5-AGGTTTGATCCTGGCTCAG-3） 和下游引物1492R（5-GGYTACCTTGTTACGACT-3（Y表示C或T堿基）），擴增菌株的16S rDNA 片段。將擴增后的DNA產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用DNA凝膠回收試劑盒純化。純化后的DNA與pMD18-T載體連接，經電轉化導入大腸桿菌感受態細胞，提取陽性克隆質粒交公司測序。將所得到的16S rDNA全序列在NCBI中進行Blast比對，選取同源性較高的典型菌株的16S rDNA序列作為參比對象，然后采用鄰接法，用MEGA 5.1構建供試菌與參比菌之間的系統進化樹，確定菌株種屬［6-8］。

1.2.3β-CGTase酶學性質測定

1）β-CGTase酶活測定采用酚酞法測定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最適溫度在反應溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的條件下，pH 7.0，反應10 min測定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對酶活。每組設3個重復，確定酶的最適反應溫度。

3）溫度對酶活穩定性的影響將酶液分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保溫1 h，以未經處理的酶活為100%，計算各溫度下保持1 h的相對酶活。

4）酶作用的最適pH分別在pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中測定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對酶活，確定酶的最適反應pH。

5） pH對酶活穩定性的影響將酶液分別在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中室溫下放置1 h，然后測定酶活。以未經處理的酶活為100%，計算不同pH下保持1 h的相對酶活。

2結果與分析

2.1β-CGTase產生菌的篩選

2.1.1初篩在所采土樣中分離出能使紅色篩選平板產生較大黃色透明圈的菌株，根據透明圈大小，得到11株CGTase產生菌。

2.1.2復篩將分離所得的11株菌進行篩選發酵試驗，經酶活測定，選出酶活較高的6株菌株，按酶活由高到低分別編號為Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故選用Hhj-1做進一步地探討，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在篩選平板上產生的透明圈如圖1所示。

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態鑒定在篩選培養基上，菌落周圍產生黃色透明圈，菌落呈微黃色，扁平呈圓形不透明，表面較干燥，邊沿不整齊，正反面顏色一致。菌株在光學顯微鏡下為桿狀，芽孢卵圓形、端生，革蘭氏染色為陽性菌。

2.2.2分子鑒定提取菌株Hhj-1基因組DNA， 通過PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（圖2）。由北京澳科鼎盛公司測得Hhj-1的16S rDNA 序列長度為1 511 bp，經過基因庫搜索比對，與Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號KF14343。在搜索比對結果中選擇與菌株Hhj-1同源性較高的16個菌株，采用鄰接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系統進化樹（圖3）。結合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，對照《常用細菌系統鑒定手冊》，鑒定菌株Hhj-1屬于坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶學性質

2.3.1酶作用的最適溫度以淀粉為底物，在35~90 ℃溫度范圍內研究了β-CGTase活性。溫度-活性曲線（圖4）表明該酶的最適溫度為70 ℃，此時酶活為3.15 U/mL，在35~65 ℃溫度范圍內，酶活隨溫度提高而迅速上升，但是當溫度高于75 ℃，酶活急劇下降，說明酶已較快地失活。

2.3.2溫度對酶活穩定性的影響將該酶在不同溫度下保溫1 h后，在pH為7.0， 65 ℃條件下測定酶活，結果如圖5所示。由圖5可以看出，在35~55 ℃下保溫1 h相對酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保溫1 h后酶活急劇下降，70~90 ℃保溫1 h相對酶活很低，幾乎失活。由此推斷，該酶適宜在中溫情況下進行催化反應。

2.3.3酶作用的最適pH以淀粉為底物，在65 ℃條件下測定β-CGTase的酶活。pH 4~10范圍內的變化情況如圖6所示。圖6結果表明，該酶所適應的pH范圍很廣，其中最適pH為7.5，此時酶活最高。同時pH為 5.5時也有一個小高峰。

2.3.4pH對酶活穩定性的影響將該酶在不同pH的緩沖液中室溫下放置1 h后，在65 ℃條件下測定β-CGTase的相對酶活，試驗結果（圖7）表明，該酶在pH 5.0～10.0的范圍內都很穩定，說明其對pH適應范圍廣，尤其在堿性范圍內相當穩定，因此在保存或進行催化反應時對pH的要求較靈活。

3結論

β-CGTase的作用底物為淀粉，故選擇淀粉含量高的枝江酒業的酵泥為土樣。篩選得到11株產CGTase的菌株，再經酚酞法測定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株編號為Hhj-1，作為出發菌株進一步研究。對菌株進行形態觀察，菌落表面干燥，圓形但邊沿不整齊。菌株為桿狀，芽孢卵圓形且端生，經革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽性菌。經16S rDNA鑒定，該菌株為坎皮納斯類芽孢桿菌，并將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號KF14343。

用酚酞法對粗酶的酶學性質進行研究，該酶的最適反應溫度為70 ℃，最適反應pH為7.5。在35~45 ℃保溫1 h相對酶活仍可保持在90%以上，且該酶在pH 5.0～10.0的范圍內都較穩定，說明其對pH適應范圍較廣，因此應用時有較大的靈活性。

參考文獻：

［1］ 孟艷芬，許波，高潤池.耐高溫β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶高產菌株XW-6-66的選育及發酵條件的研究［J］. 食品科技，2009，34（5）:10-15.

［2］ 陳龍然，袁康培，馮明光，等. 一株產環糊精葡萄糖基轉移酶的地衣芽孢桿菌的選育、產酶條件及酶學特性［J］. 微生物學報，2005，45（1）:97-101.

［3］ 曹新志，金征宇.環糊精葡萄糖基轉移酶高產菌株的快速篩選［J］. 中國糧油學報，2003，18（6）:53-55.

［4］ 俞玲. 地衣芽孢桿菌pelB，amyX，yvdF基因的功能鑒定與表達［D］.江蘇無錫：江南大學，2009.

［5］ 孫娟娟. 普魯蘭酶在解淀粉芽孢桿菌中表達方法的探索［D］.江蘇無錫：江南大學，2011.

［6］ 郭鳳蓮，陳存社.產淀粉酶枯草芽孢桿菌的16S rRNA測序鑒定［J］. 中國釀造，2007（8）:26-28.

［7］ 周發俊. 甘蔗內生固氮菌的分離鑒定及16S rRNA基因克隆和序列分析［D］.福州：福建師范大學，2009.

［8］ 董安國，高琳，趙建邦，等. 基于DNA序列的系統進化樹構建［J］. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2008，36（10）：221-226.

［9］ KUO C C， LIN C A ， CHEN J Y，et al. Production of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus sp. by pH-stat fed-batch fermentation［J］. Biotechnol Lett，2009，31（11）:1723-1727.

［10］ BERHANE T. Optimum extracellular production of recombinant cyclodextrin glucanotransferase from Anawrbranca gottschalkii and its cyclodextrin products［D］.江蘇無錫：江南大學，2012.

［11］ LETSIDIDI R. Production and purification of a thermostable cyclodestrin glycosyltransferase with a high starch hydrolytic activity from Bacillus licheniformis SK13.002 and its applicaton for β-cyclodextrin production［D］. 江蘇無錫：江南大學，2010.

［12］李明時，張帆. β-環糊精的分光光度測定［J］. 分析化學，1998，26（7）：912.

［13］ 劉燕華. 分光光度法測定β-環狀糊精［J］. 日用化學工業，1990（6）：35-36.

1.2.3β-CGTase酶學性質測定

1）β-CGTase酶活測定采用酚酞法測定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最適溫度在反應溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的條件下，pH 7.0，反應10 min測定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對酶活。每組設3個重復，確定酶的最適反應溫度。

3）溫度對酶活穩定性的影響將酶液分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保溫1 h，以未經處理的酶活為100%，計算各溫度下保持1 h的相對酶活。

4）酶作用的最適pH分別在pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中測定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對酶活，確定酶的最適反應pH。

5） pH對酶活穩定性的影響將酶液分別在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中室溫下放置1 h，然后測定酶活。以未經處理的酶活為100%，計算不同pH下保持1 h的相對酶活。

2結果與分析

2.1β-CGTase產生菌的篩選

2.1.1初篩在所采土樣中分離出能使紅色篩選平板產生較大黃色透明圈的菌株，根據透明圈大小，得到11株CGTase產生菌。

2.1.2復篩將分離所得的11株菌進行篩選發酵試驗，經酶活測定，選出酶活較高的6株菌株，按酶活由高到低分別編號為Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故選用Hhj-1做進一步地探討，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在篩選平板上產生的透明圈如圖1所示。

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態鑒定在篩選培養基上，菌落周圍產生黃色透明圈，菌落呈微黃色，扁平呈圓形不透明，表面較干燥，邊沿不整齊，正反面顏色一致。菌株在光學顯微鏡下為桿狀，芽孢卵圓形、端生，革蘭氏染色為陽性菌。

2.2.2分子鑒定提取菌株Hhj-1基因組DNA， 通過PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（圖2）。由北京澳科鼎盛公司測得Hhj-1的16S rDNA 序列長度為1 511 bp，經過基因庫搜索比對，與Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號KF14343。在搜索比對結果中選擇與菌株Hhj-1同源性較高的16個菌株，采用鄰接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系統進化樹（圖3）。結合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，對照《常用細菌系統鑒定手冊》，鑒定菌株Hhj-1屬于坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶學性質

2.3.1酶作用的最適溫度以淀粉為底物，在35~90 ℃溫度范圍內研究了β-CGTase活性。溫度-活性曲線（圖4）表明該酶的最適溫度為70 ℃，此時酶活為3.15 U/mL，在35~65 ℃溫度范圍內，酶活隨溫度提高而迅速上升，但是當溫度高于75 ℃，酶活急劇下降，說明酶已較快地失活。

2.3.2溫度對酶活穩定性的影響將該酶在不同溫度下保溫1 h后，在pH為7.0， 65 ℃條件下測定酶活，結果如圖5所示。由圖5可以看出，在35~55 ℃下保溫1 h相對酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保溫1 h后酶活急劇下降，70~90 ℃保溫1 h相對酶活很低，幾乎失活。由此推斷，該酶適宜在中溫情況下進行催化反應。

2.3.3酶作用的最適pH以淀粉為底物，在65 ℃條件下測定β-CGTase的酶活。pH 4~10范圍內的變化情況如圖6所示。圖6結果表明，該酶所適應的pH范圍很廣，其中最適pH為7.5，此時酶活最高。同時pH為 5.5時也有一個小高峰。

2.3.4pH對酶活穩定性的影響將該酶在不同pH的緩沖液中室溫下放置1 h后，在65 ℃條件下測定β-CGTase的相對酶活，試驗結果（圖7）表明，該酶在pH 5.0～10.0的范圍內都很穩定，說明其對pH適應范圍廣，尤其在堿性范圍內相當穩定，因此在保存或進行催化反應時對pH的要求較靈活。

3結論

β-CGTase的作用底物為淀粉，故選擇淀粉含量高的枝江酒業的酵泥為土樣。篩選得到11株產CGTase的菌株，再經酚酞法測定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株編號為Hhj-1，作為出發菌株進一步研究。對菌株進行形態觀察，菌落表面干燥，圓形但邊沿不整齊。菌株為桿狀，芽孢卵圓形且端生，經革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽性菌。經16S rDNA鑒定，該菌株為坎皮納斯類芽孢桿菌，并將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號KF14343。

用酚酞法對粗酶的酶學性質進行研究，該酶的最適反應溫度為70 ℃，最適反應pH為7.5。在35~45 ℃保溫1 h相對酶活仍可保持在90%以上，且該酶在pH 5.0～10.0的范圍內都較穩定，說明其對pH適應范圍較廣，因此應用時有較大的靈活性。

參考文獻：

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［2］ 陳龍然，袁康培，馮明光，等. 一株產環糊精葡萄糖基轉移酶的地衣芽孢桿菌的選育、產酶條件及酶學特性［J］. 微生物學報，2005，45（1）:97-101.

［3］ 曹新志，金征宇.環糊精葡萄糖基轉移酶高產菌株的快速篩選［J］. 中國糧油學報，2003，18（6）:53-55.

［4］ 俞玲. 地衣芽孢桿菌pelB，amyX，yvdF基因的功能鑒定與表達［D］.江蘇無錫：江南大學，2009.

［5］ 孫娟娟. 普魯蘭酶在解淀粉芽孢桿菌中表達方法的探索［D］.江蘇無錫：江南大學，2011.

［6］ 郭鳳蓮，陳存社.產淀粉酶枯草芽孢桿菌的16S rRNA測序鑒定［J］. 中國釀造，2007（8）:26-28.

［7］ 周發俊. 甘蔗內生固氮菌的分離鑒定及16S rRNA基因克隆和序列分析［D］.福州：福建師范大學，2009.

［8］ 董安國，高琳，趙建邦，等. 基于DNA序列的系統進化樹構建［J］. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2008，36（10）：221-226.

［9］ KUO C C， LIN C A ， CHEN J Y，et al. Production of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus sp. by pH-stat fed-batch fermentation［J］. Biotechnol Lett，2009，31（11）:1723-1727.

［10］ BERHANE T. Optimum extracellular production of recombinant cyclodextrin glucanotransferase from Anawrbranca gottschalkii and its cyclodextrin products［D］.江蘇無錫：江南大學，2012.

［11］ LETSIDIDI R. Production and purification of a thermostable cyclodestrin glycosyltransferase with a high starch hydrolytic activity from Bacillus licheniformis SK13.002 and its applicaton for β-cyclodextrin production［D］. 江蘇無錫：江南大學，2010.

［12］李明時，張帆. β-環糊精的分光光度測定［J］. 分析化學，1998，26（7）：912.

［13］ 劉燕華. 分光光度法測定β-環狀糊精［J］. 日用化學工業，1990（6）：35-36.

1.2.3β-CGTase酶學性質測定

1）β-CGTase酶活測定采用酚酞法測定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最適溫度在反應溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的條件下，pH 7.0，反應10 min測定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對酶活。每組設3個重復，確定酶的最適反應溫度。

3）溫度對酶活穩定性的影響將酶液分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保溫1 h，以未經處理的酶活為100%，計算各溫度下保持1 h的相對酶活。

4）酶作用的最適pH分別在pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中測定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對酶活，確定酶的最適反應pH。

5） pH對酶活穩定性的影響將酶液分別在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中室溫下放置1 h，然后測定酶活。以未經處理的酶活為100%，計算不同pH下保持1 h的相對酶活。

2結果與分析

2.1β-CGTase產生菌的篩選

2.1.1初篩在所采土樣中分離出能使紅色篩選平板產生較大黃色透明圈的菌株，根據透明圈大小，得到11株CGTase產生菌。

2.1.2復篩將分離所得的11株菌進行篩選發酵試驗，經酶活測定，選出酶活較高的6株菌株，按酶活由高到低分別編號為Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故選用Hhj-1做進一步地探討，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在篩選平板上產生的透明圈如圖1所示。

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態鑒定在篩選培養基上，菌落周圍產生黃色透明圈，菌落呈微黃色，扁平呈圓形不透明，表面較干燥，邊沿不整齊，正反面顏色一致。菌株在光學顯微鏡下為桿狀，芽孢卵圓形、端生，革蘭氏染色為陽性菌。

2.2.2分子鑒定提取菌株Hhj-1基因組DNA， 通過PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（圖2）。由北京澳科鼎盛公司測得Hhj-1的16S rDNA 序列長度為1 511 bp，經過基因庫搜索比對，與Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號KF14343。在搜索比對結果中選擇與菌株Hhj-1同源性較高的16個菌株，采用鄰接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系統進化樹（圖3）。結合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，對照《常用細菌系統鑒定手冊》，鑒定菌株Hhj-1屬于坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶學性質

2.3.1酶作用的最適溫度以淀粉為底物，在35~90 ℃溫度范圍內研究了β-CGTase活性。溫度-活性曲線（圖4）表明該酶的最適溫度為70 ℃，此時酶活為3.15 U/mL，在35~65 ℃溫度范圍內，酶活隨溫度提高而迅速上升，但是當溫度高于75 ℃，酶活急劇下降，說明酶已較快地失活。

2.3.2溫度對酶活穩定性的影響將該酶在不同溫度下保溫1 h后，在pH為7.0， 65 ℃條件下測定酶活，結果如圖5所示。由圖5可以看出，在35~55 ℃下保溫1 h相對酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保溫1 h后酶活急劇下降，70~90 ℃保溫1 h相對酶活很低，幾乎失活。由此推斷，該酶適宜在中溫情況下進行催化反應。

2.3.3酶作用的最適pH以淀粉為底物，在65 ℃條件下測定β-CGTase的酶活。pH 4~10范圍內的變化情況如圖6所示。圖6結果表明，該酶所適應的pH范圍很廣，其中最適pH為7.5，此時酶活最高。同時pH為 5.5時也有一個小高峰。

2.3.4pH對酶活穩定性的影響將該酶在不同pH的緩沖液中室溫下放置1 h后，在65 ℃條件下測定β-CGTase的相對酶活，試驗結果（圖7）表明，該酶在pH 5.0～10.0的范圍內都很穩定，說明其對pH適應范圍廣，尤其在堿性范圍內相當穩定，因此在保存或進行催化反應時對pH的要求較靈活。

3結論

β-CGTase的作用底物為淀粉，故選擇淀粉含量高的枝江酒業的酵泥為土樣。篩選得到11株產CGTase的菌株，再經酚酞法測定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株編號為Hhj-1，作為出發菌株進一步研究。對菌株進行形態觀察，菌落表面干燥，圓形但邊沿不整齊。菌株為桿狀，芽孢卵圓形且端生，經革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽性菌。經16S rDNA鑒定，該菌株為坎皮納斯類芽孢桿菌，并將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號KF14343。

用酚酞法對粗酶的酶學性質進行研究，該酶的最適反應溫度為70 ℃，最適反應pH為7.5。在35~45 ℃保溫1 h相對酶活仍可保持在90%以上，且該酶在pH 5.0～10.0的范圍內都較穩定，說明其對pH適應范圍較廣，因此應用時有較大的靈活性。

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