廣西2月齡內犢奶牛隱孢子蟲感染情況調查

魏曉瑞，陶 立，李 軍，謝永平，閉炳芬，陳澤祥，韋志鋒，秦若甫，蘭美益，彭 昊，楊 威，王曉麗

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；2.廣西獸醫研究所，廣西 南寧 530001；3.廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西 南寧 530001）

自Tyzzer（1907）首次發現小鼠隱孢子蟲（C.muris）以來，國內外學者對隱孢子蟲病進行了大量研究，已在人、哺乳動物、禽類、爬行動物和魚類等多種動物中發現15個種類的隱孢子蟲感染[1-3]，其中可感染牛的隱孢子蟲種為安氏隱孢子蟲（C.an?dersoni）、小球隱孢子蟲(C.parvum)、牛隱孢子蟲(C.bovis)、小鼠隱孢子蟲(C.muris)、犬隱孢子蟲(C.ca?nis)、貓隱孢子蟲(C.fells)、豬隱孢子蟲(C.suis)、鹿樣基因型（C.deer-like genotype）和賴氏隱孢子蟲（C.ryanae）[4-5]。隱孢子蟲對牛的感染與牛的年齡呈正相關性[6]。本實驗室對廣西奶牛隱孢子蟲病流行病學的調查結果顯示，廣西奶牛感染的隱孢子蟲種類為安氏隱孢子蟲，由于調查的時間錯過了產犢高峰期，對2月齡內犢牛的調查樣本數相對偏少，有可能造成漏檢[7]。為了更能全面準確地反映廣西奶牛隱孢子蟲感染的種類和流行情況，本實驗室在2011年9月至2012年1月采用醛-酯法預處理糞樣，再經飽和糖溶液漂浮、抗酸染色法和PCR鑒定檢測了廣西7個黑白花奶牛場2月齡內犢牛隱孢子蟲感染狀況。

1 材料與方法

1.1 材料 待檢糞樣： 采集7個廣西黑白花奶牛場617頭2月齡以內犢牛的新鮮糞便，每頭糞樣10～30 g左右，分裝于潔凈的塑料袋內，編號和標記牛的日齡及自然狀況，置4℃冰箱待檢。

主要試劑及配制：乙酸乙酯溶液、10%福爾馬林溶液、飽和蔗糖溶液（食用白糖500 g，蒸餾水350 mL，石炭酸7.0 mL，比重為1.28）。改良抗酸染色液分別是甲液（堿性復紅4 g，95%酒精20 mL，石碳酸8 mL，蒸餾水100 mL）、乙液（硫酸10 mL，蒸餾水90 mL）、丙液（0.2 g孔雀綠溶于蒸餾水100 mL）。甲醇，2.5%重鉻酸鉀溶液。PCR Taq Mix、DNA Marker1，購自廣州東盛生物科技有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

主要儀器：PCR儀，購自TaKaRa公司；凝膠成像系統，購自Alpha Inotech公司。

1.2 方法

1.2.1 犢牛糞樣處理和飽和蔗糖液漂浮 取每份糞樣5～10 g，加適量10%福爾馬林溶液，充分搗碎、攪勻，60目銅篩過濾，濾液再經260目尼龍篩過濾，將濾液置離心管中，3000 r/min離心10 min，棄上清液后，在沉淀中加入5倍體積以上的10%福爾馬林溶液充分混勻，再加入福爾馬林溶液2/5體積的乙酸乙酯溶液充分混勻，3000 r/min離心10 min，棄上清。沉淀中加入約3/4試管體積的蒸餾水充分混勻，3000 r/min離心10 min，棄上清。最后在沉淀中加適量的飽和蔗糖溶液，攪勻后3000 r/min離心10 min。用鐵絲環蘸取表層液膜制片，于400×鏡下觀察。

1.2.2 改良抗酸染色法 取1.2.1的沉淀物涂片，自然干燥，甲醇固定5 min，滴加甲液于糞膜上，5～10 min后水洗；滴加乙液，1～5 min后水洗；滴加丙液，1 min后水洗，晾干后1000×油鏡下觀察。

1.2.3 卵囊形態學鑒定 每張玻片觀察100個視野，在400×鏡下測量卵囊的大小，根據卵囊的長短徑計算卵囊指數，觀察卵囊的形態結構。

1.2.4 PCR鑒定 取陽性糞樣200 mg，應用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便DNA進行隱孢子蟲的種類鑒定[8]。

2 結果

2.1 廣西2月齡內犢奶牛隱孢子蟲感染情況 共調查7個黑白花奶牛場，檢測糞樣617頭份，其中6個場為隱孢子蟲感染陽性場，共檢出陽性糞樣57頭份，場均感染陽性率為9.24%（表1），隱孢子蟲卵囊的檢出與犢奶牛的年齡呈一定的相關性（圖1）。

2.2 蟲種鑒定

圖1 隱孢子蟲感染與犢牛日齡的關系

2.2.1 卵囊形態和大小 糞樣經醛—酯法和飽和蔗糖溶液漂浮法處理后，用鐵絲環蘸取糞樣的表層液膜制片，于400×鏡下觀察發現隱孢子蟲卵囊呈粉紅色，橢圓形或圓形，囊壁薄而光滑，周圍有淡綠色光圈，無微孔和極粒，內有月牙形的子孢子。經改良抗酸染色法處理的樣品，在1000×油鏡下觀察，藍綠色的背景上卵囊呈鮮艷的玫瑰紅色，卵囊為橢圓形或圓形，囊內有月牙形的空泡，但多數卵囊內部結構不清楚（圖2）。卵囊大小為6.26μm～8.38μm×4.20 μm～5.35μm，平均7.48μm×5.23μm，卵囊形狀指數（長/寬）1.07～1.60，平均為 1.36（n=100）。

圖2 隱孢子蟲卵囊（改良抗酸染色法） （1000×）

2.2.2 PCR鑒定 應用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便DNA進行隱孢子蟲的種類鑒定，結果表明檢測到的隱孢子蟲均為安氏隱孢子蟲（圖3）。

圖3 PCR基因分型

3 討論

對廣西7個黑白花奶牛場的617頭份2月齡內犢牛糞樣檢測發現，廣西2月齡內犢奶牛隱孢子蟲感染率為9.24%，57份陽性糞樣檢測到的卵囊形態學相近或一致，經PCR鑒定證實為安氏隱孢子蟲，這和我們之前調查相一致[7]，說明安氏隱孢子蟲是感染廣西黑白花奶牛隱孢子蟲的主要種類。

研究表明，小球隱孢子蟲是感染犢牛的主要隱孢子蟲蟲種，其感染高峰期為1-15日齡，21-60日齡奶牛感染的蟲種60%～90%為小球隱孢子蟲，其余為牛隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲和鹿樣基因型，3-11月齡僅見牛隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲和鹿樣基因型的感染，而無小球隱孢子蟲感染[6-9]；Wang等(2000)也認為小球隱孢子蟲主要寄生于斷奶前犢牛，牛隱孢子蟲和賴氏隱孢子蟲主要寄生于斷奶后犢牛和青年牛，安氏隱孢子蟲常見于成年牛[5]。我們的調查表明，目前廣西2月齡犢牛感染的隱孢子蟲種類為安氏隱孢子蟲，是否還有小球隱孢子蟲的感染還有待深入調查。

2月齡內犢牛由于還沒有斷奶，糞便中含脂質較多，黏稠不易被水洗開，即使用飽和蔗糖溶液漂浮也會因脂質顆粒無法觀察到卵囊，用醛-酯法處理糞樣可解決糞便中脂質的問題，大大地提高了檢出率。

檢測發現F場的陽性率特別高，達到34.0%。這與該場犢牛混群飼養、擁擠和環境衛生極差有關，糞尿橫流極易污染飼料和水源，導致犢牛的重復感染。因此，一定要注意犢牛的飼養管理，按日齡大小分群，保持合理的飼養密度和空間，及時清除糞便、清掃場地，搞好環境衛生。

[1]Ryan U M，Monisp，Enemark H L，et al.Suis n sp(Apicomplexa:Cryptosporididae)in pigs(Susscrofa)[J].J Parasitol，2004，90(4):769-773.

[2]Fayer R，Santin M，Xiao L.Cryptosporidium bovis n sp(Apicom?plexa:Cryptosporididae)in cattle(Bos taurus)[J].J P arasitol，2005，91(3):624-629.

[3]Xiao L，Fayer R，Ryan U M，et al.Cryptosporidiumtaxonomy:re?centadvances and implications for public health[J].Clin Microbi?ol Rev，2004，17:72-97.

[4]梁楠，菅復春，寧長申，等.牛隱孢子蟲和隱孢子蟲病的研究進展[J].中國獸醫科學，2006，36（12）：1024-1030.

[5]Wang R，Ma G，Zhao J，et al.Cryptosporidium andersoni is the predominantspecies in pose-weaned and adult dairy cattle in Chi?na[J].Parasitol Int，2011，60(1):1-4.

[6]Wade S E，Mohammed H O，Schaaf S L.Prevalence of Giardia sp，Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium muris(C.andersoni)in 109 dairy herds in five counties of southeasten New York[J].Vet Parasitol，2000，93(1):1-11.

[7]陶立，陳澤祥，韋志鋒，等.廣西奶牛隱孢子蟲病的流行病學調查[J].中國獸醫科學，2012，42（7）：742-746.

[8]彭昊，李軍，陶立，等.牛隱孢子蟲多重PCR方法的建立及應用[J].中國人獸共患病學報，2012，28(8):825-828.

[9]Santin M，Trout J M，Xiao Li，et al.Prevalence and age related variation of Cryptosporidium species and genotypes in dairy calves[J].Vet Parasitol，2004，122（2）:103-117.