非洲豬瘟病毒E183L、B 602L、K 205R和A 104R基因表達及診斷抗原篩選

張鑫宇，陳 宇，劉文俊，夏曉莉，孫懷昌

（揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009）

非洲豬瘟（African swine fever,ASF）是一種由ASFV引起家豬和野豬的傳染病，具有死亡率高和傳播迅速的特點[1]。1921年該病最早發現于東非的肯尼亞[2]，以后的幾十年內傳播到非洲、歐洲、美洲等許多國家，并且有繼續蔓延的趨勢[3-4]，目前雖然該病尚未傳入我國，但近年來鄰國大面積的流行[5]，使得我國面臨嚴重威脅。

本研究選擇了ASFV4種基因，其中ASFV E183L基因編碼的p54蛋白，其抗體具有一定的病毒中和能力[6]；B602L基因編碼的pB602L蛋白，可刺激機體產生較高水平的抗體[7]；K205R基因是一早期轉錄基因，其編碼的pK205R蛋白能較早刺激機體產生抗體[7]；A104L基因編碼的組氨酸樣蛋白，能與ASFV抗體陽性血清發生免疫沉淀反應[8]。構建了攜帶這4種基因的重組載體，表達并純化出重組蛋白pA104L、p54、pK205R和pB602L，分別以這4種重組蛋白包被酶標板，ELISA方法篩選可以用于ASFV抗體檢測的診斷抗原，具體過程如下。

1 材料與方法

1.1 材料 重組質粒pGEX-4T-1-E183L、pGEX-4T-1-B602L、pGEX-4T-1-K205R和pGEX-4T-1-A104R 由 Gulbenkian de Ciência研 究 所 Parkhouse R M教授惠贈；原核表達載體pET-30a（+）、大腸桿菌BL21（DE3），購自Novagen公司；限制性內切酶、連接酶、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、dNTP；Ni-NTA瓊脂糖，購自Qiagen公司；HRP標記羊抗豬IgG（H+L），購自Earthox公司；OPD，購自Sigma公司；ASFV抗體陰性、陽性血清由英國Pirbright研究所提供；其他化學試劑均為國產分析純級試劑。

1.2 方法

1.2.1 表達載體構建 根據ASFV Ba71V株基因組序列（GenBank No.U18466.1）設計針對基因E183L和B602L特異性引物：p54F 5′-TAGAATTCCTATTCTCTTCAAGAAAG-3′，p54R 5′-TACTCGAGTTACAAGGAGTTTTCTAGG-3′；pB602LF 5′-CTGAATTCATGGCAGAATTTAATATT?GATGAGCTTC-3′，pB602LR 5′-CTGCGGCCGCTTAC AATTCTGCTTTTGTATATAAAATT-3′，其中E183L上游引物從該基因第151核苷酸開始。以質粒pGEX-4T-1-E183L和pGEX-4T-1-B602L為模板，分別擴增一段402bp的E183L基因及B602L基因，擴增產物用限制酶EcoRⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ、NotⅠ消化后，插入表達載體pET-30a（+），構建重組質粒pET-p54和pETB602L，并轉化感受態大腸桿菌BL21（DE3）。用限制內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切質粒pGEX-4T-1-K205R和pGEX-4T-1-A104R，將酶切下的小片段DNA插入載體pET-30a（+），構建重組質粒pET-K205R和pETA104R，轉化感受態大腸桿菌BL21（DE3）。

1.2.2 重組蛋白表達 將上述4種重組菌按1∶100接種2 mL卡那霉素（50μg/mL）2×YTK培養基，37℃培養至4 h，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃誘導表達4 h，離心沉淀菌體。0.01 moL/L pH值7.6 PBS洗滌2遍，400μL PBS懸浮菌體，加入400μL 2×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，10000 r/min離心5 min后，取上清液進行SDS-PAGE（12%分離膠），電泳結束后，考馬斯亮藍G-250溶液染色3 h，用脫色液脫色，分析外源基因是否表達，同時設空載體轉化菌對照。

1.2.3 表達產物純化及鑒定 按照上述方法按比例進行重組菌擴大培養和誘導表達，離心沉淀菌體用PBS洗滌2遍，用超聲波裂解儀裂解菌體，10000 r/min離心10 min，分別取部分離心上清及沉淀進行SDS-PAGE分析，確定表達產物是可溶的還是以包涵體形式存在。

按照Qiagen公司說明書，用His親和層析凝膠純化表達的重組蛋白，ND-1000紫外分光光度計（Nano Drop公司）定量蛋白濃度，并用0.01 mol/L pH值7.4 PBS調整最終濃度為1 mg/mL。Western blotting鑒定純化的4種重組蛋白，所用的一抗為200倍56℃滅活2 h的ASFV抗體陽性豬血清，二抗為10000倍辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG，最終用DAB顯色。

1.2.4 間接ELISA 純化的抗原包用0.05 mol/L pH值9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后，包被NUC公司96孔酶標板，100μL/孔，37℃作用2 h；PBST洗滌液（0.01 mol/L pH值7.6 PBS，0.05%Tween-20）洗板2次，200 μL/孔，3 min/次；加入封閉液（0.01 mol/L pH值7.6 PBS，5%脫脂乳粉），200μL/孔，37℃作用1 h；洗板2次后，加入用封閉液200倍稀釋的血清，100μL/孔，37℃作用1 h；洗板4次后，加入1倍工作濃度的HRP標記羊抗豬IgG（H+L），100μL/孔，37℃作用1 h；洗板4次后，吸水紙上拍干板孔中液體，加入新鮮配制的OPD底物溶液，100μL/孔，室溫靜置15 min；加入2 mol/L H2SO終止反應，50μL/孔；酶標儀490 nm波長下，讀取每孔吸光值。

2 結果

2.1 表達載體鑒定 將PCR產物及酶切產物插入載體pET-30a（+），限制內切酶酶切重組質粒pET-p54、pET-B602L、pET-K205R和pET-A104R進行鑒定，結果分別切下大小約402 bp、1809 bp、618 bp和315bp的DNA條帶（圖1），確認構建的重組載體正確。

圖1 重組載體酶切鑒定

2.2 重組蛋白表達 IPTG分別誘導攜帶重組質粒pET-A104R、pET-B602L、pET-p54、pET-K205R的大腸桿菌表達，SDS-PAGE電泳裂解產物，結果上述4種重組菌分別表達預期大小的pA104R、pB602R、p54、pK205R重組蛋白，分子量分別為19 kDa、75 kDa、21 kDa和25 kDa，而誘導及空載體對照無相應的蛋白條帶。

2.3 重組蛋白純化及鑒定 IPTG誘導重組菌表達后，超聲波裂解菌體，分別取離心上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，結果顯示，除重組蛋白pK205R以包涵體形式存在外，其他3種重組蛋白pA104R、pB602R、p54均為可溶性蛋白。分別在尿素變性和非變性條件下進行Ni柱親和純化，純化產物進行Western-blotting分析，結果顯示，純化的重組蛋白pA104R、pK205R、pB602R、p54與ASFV免疫血清均呈陽性反應（圖2）。

圖2 純化的重組蛋白W estern-blotting分析

2.4 血清學診斷抗原篩選

2.4.1 重組蛋白檢測高滴度的ASFV抗體 將重組蛋白p54、pB602R、pK205R和pA104R梯度稀釋后包被酶標板，以ASFV弱毒OURT88/3接種后第20天感染強毒OURT88/1存活下來的豬血清為檢測對象，間接ELISA測定其抗體，同時設立ASFV抗體陰性對照，結果重組抗原pK205R、p54和pB602L血清學反應較好，但pB602L與陰性血清有輕微的交叉反應（圖3）。

2.4.2 重組蛋白檢測不同時期的ASFV抗體 將重組蛋白p54、pB602R、pK205R和pA104R稀釋成2μg/mL，包被酶標板，以ASFV弱毒OURT88/3接種后第6、13、19天采集的豬血清為檢測對象，間接ELISA測定其抗體，同時設立ASFV抗體陰性對照，結果重組抗原p54在13 d時檢測效果最好，pK205R次之（圖4）。

圖3 間接ELIS A檢測高滴度A S FV抗體

圖4 間接ELIS A檢測A S FV感染后不同時期的抗體

3 討論

非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種復雜的大DNA病毒，豬或野豬感染后，潛伏期通常為3～15 d，強毒株感染的死亡率可達到100%，毒力稍弱的毒株感染后表現為發熱、精神沉郁等癥狀，低毒株感染出現亞臨床癥狀或僅血清抗體轉陽，易與豬其他疾病混淆[1]。OIE認為，在ASF流行疫區和低毒力ASFV感染初期地區進行調查、診斷，血清學方法是首推的診斷方法，而以純化的重組蛋白作為檢測抗原，比病毒感染后的可溶性細胞裂解更具優勢[9]。

ASFV感染豬巨噬細胞后，細胞內至少可表達100種病毒蛋白，其中約50種能與感染或康復期豬血清發生抗原抗體反應[10]，2009年，Gallardo等[11]從ASFV感染康復豬血清中篩選到12種較強免疫原性 抗 原，以其中的 p54、pB602L、pK205R 和pA104L重組蛋白為抗原，分別建立了檢測ASFV抗體的ELISA方法，田間檢測發現，該ELISA方法與OIE推薦的ELISA方法具有較高的檢測符合率。這些重組蛋白融合標簽為谷胱甘肽S轉移酶（GST），由于其分子量較大（26kDa），造成ELISA背景值較高，檢測時需要設立GST本底對照。本研究對ASFV E183L、B602L、K205R和A104R基因進行了亞克隆，其中的E183L基因，由于前150個核苷酸編碼疏水性蛋白和無B細胞表位蛋白，因此將其切除，并融合上組氨酸（His）標簽，以表達純化的重組蛋白為抗原進行ELISA試驗，結果反應背景大大降低，檢測時也不需要設立本底對照。

用不同抗原建立的間接ELISA分別檢測ASFV感染后豬血清中的抗體，發現在感染后的中后期，pK205R、p54和pB602L檢測效果較好，而在感染早期抗體檢測時，p54檢測效果最好，pK205R次之。由此可見，4種重組蛋白中，p54和pK205R無論在ASFV感染早期還是中后期，均可用作診斷抗原檢測相應的抗體，這對今后檢測ASFV抗體試劑盒的開發具有重要的指導意義。

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