龐 卯， 楊 陽， 劉 斌， 張良明， 戎利民

(中山大學附屬第三醫院脊柱外科，廣東 廣州 510630)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是一種常見的中樞神經損傷，通常導致四肢軀干運動和感覺功能的部分喪失，甚至截癱。目前脊髓損傷的治療仍然是一個世界性的問題[1-2]。細胞移植治療為脊髓損傷的修復提供了一種新的方法，常用的可供移植的細胞有神經干細胞、雪旺細胞、嗅鞘細胞和骨髓間充質干細胞[1]。因涉及到從人類胚胎或其它組織中獲取細胞，故同種異體免疫排斥和倫理問題是限制其臨床應用的主要障礙[3]。獲得一種既能夠多能性分化，又可避免免疫排斥反應的干細胞對于脊髓損傷的治療具有重要的意義。誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)給我們提供了一個新策略[4]。Takahashi等[5]利用逆轉錄病毒載體將Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種轉錄因子轉移至小鼠成纖維細胞中，首次獲得iPSCs。先前的研究也指出iPSCs可以分化為神經干細胞以及進一步分化為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞[6-7]。因此，在脊髓損傷的實驗性自體細胞移植治療中，iPSCs顯示出了廣闊的前景[8]。已有報道不同來源的iPSCs可以分化為神經元，但分離過程較為冗繁[7,9]。本文旨在前期研究的基礎上探討如何大量、穩定、簡便地將iPSCs定向分化為神經元，從而為其巨大治療潛能的發揮奠定體外實驗基礎。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

小鼠iPSc細胞系購自中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院；胎牛血清、DMEM高糖培養基、DMEM/F12培養基、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(non-essential amino acid, NEAA)、N2添加物(N2 supplement)、B27添加物(B27 supplement)、含有EDTA的胰酶、β-巰基丙醇、明膠溶液、Neurobasal培養基和ITS-A(insulin-transferrin-selenium-A)添加物均購自Gibco；白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)購自Millipore；維甲酸(retinoic acid,RA)購自Sigma；堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)購自Peprotech；兔抗小鼠Oct4、Sox2和SSEA1抗體購自Santa Cruz；兔抗小鼠巢蛋白(nestin)單克隆抗體購自Abcam；兔抗小鼠微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)單克隆抗體購自Millipore；兔抗小鼠膠質細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)單克隆抗體和兔抗小鼠髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)單克隆抗體購自北京博奧森生物公司；FITC標記驢抗兔IgG購自Life；FITC標記羊抗兔IgG購自Abgent；0.1% Triton X-100穿膜劑購自天津光復精細化工研究所；6%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液購自廣州碧云天生物公司；染核試劑Hoechst 33342購自廣州齊云生物公司；甲醇和磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline solution,PBS)購自廣州化學試劑廠。

2 方法

2.1培養基 小鼠iPSCs培養基：DMEM高糖培養基、15%胎牛血清、1%非必須氨基酸、1 mmol/L L-谷氨酰胺、1%β-巰基乙醇和0.1%LIF。擬胚體(embryoid body, EB)培養基：不含LIF的iPSCs培養基。神經干細胞(neural stem cells,NSCs)誘導培養基： Neurobasal培養基、DMEM/F12培養基、1% N2 supplement、2% B27 supplement 和1% ITS-A。NSCs培養基：DMEM/F12培養基、2 mmol/L GlutaMAX、2% B27 supplement 、20 μg/L bFGF和20 μg/L EGF。神經元誘導培養基：DMEM/F12培養基、5%胎牛血清和1 μmol/L RA。小鼠成纖維細胞培養基：DMEM高糖培養基和10%胎牛血清。

2.2小鼠iPSCs傳代培養 將小鼠的iPSCs接種于經10 mg/L絲裂霉素C處理過的第3代小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)飼養層上，使用iPSCs培養基培養。待集落長滿飼養層，用0.25%含有EDTA的胰酶消化，血清終止消化后將集落吹下，加入3～5 mL培養液，輕輕吹散成小集落，均勻接種于飼養層細胞上。

2.3小鼠iPSCs向NSCs的定向分化 取生長狀態良好的小鼠iPSCs，使用0.25%含有EDTA的胰酶消化，用不含LIF的EB培養基吹打成小的細胞團，接種到低黏附的細菌培養皿中培養2 d，觀察EB的形成。收集懸浮培養2 d的EB，用含1 μmol/L RA的EB培養基誘導培養2 d促進其進一步分化。第5天時將EB置于0.1%明膠溶液包被過的6孔板中，換用NSCs誘導培養基中，隔天換液。7 d后在解剖顯微鏡下使用巴氏管將rosette結構外已“爬出”的細胞分離成“碎片狀”細胞集落甚至單個細胞后，再次轉移至低黏附的細菌培養皿中促進神經球(neurosphere)形成。

2.4小鼠NSCs向神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的分化 NSCs懸浮培養7 d后，將其轉移至含1 μmol/L RA及胎牛血清的分化培養基中貼壁培養，倒置顯微鏡下觀察誘導后細胞的形態變化。

3 iPSCs及其分化的神經譜系鑒定

3.1iPSCs內干細胞特異性標志物堿性磷酸酶檢測 PBS清洗細胞3遍，加入冰甲醇4 ℃環境中固定細胞10 min；棄除冰甲醇，PBS清洗3遍，每次5 min；加入1 mL AP顯色液，室溫暗盒中靜置15 min，PBS洗2遍后，每孔加入2 mL PBS, 倒置顯微鏡下拍照。

3.2免疫熒光染色檢測Oct4、Sox2、SSEA1、nestin、MAP-2、GFAP及MBP的表達 PBS清洗細胞3遍，加入冰甲醇4 ℃環境中固定細胞10 min；棄除冰甲醇，PBS清洗3遍，每次5 min；加入0.1% Triton X-100及6% BSA等體積穿膜封閉混合液，室溫避光孵育1 h；PBS清洗3遍，每次5 min，加入兔抗小鼠Oct4 Ⅰ抗(1∶250)、Sox2 Ⅰ抗(1∶250)、SSEA1 Ⅰ抗(1∶250)、nestin Ⅰ抗(1∶1 000)、MAP-2 Ⅰ抗(1∶1 000)、GFAP Ⅰ抗(1∶200)及MBP Ⅰ抗(1∶200)，4 ℃環境中孵育過夜；第2天吸除 Ⅰ抗溶液，PBS清洗3遍，每次5 min，加入羊抗兔熒光標記Ⅱ抗(1∶50)或驢抗兔熒光標記Ⅱ抗(1∶400)，室溫孵育1 h；吸除Ⅱ抗溶液，PBS清洗3遍，每次5 min，Hoechst 33342染核2～3 min；吸除染核試劑，添加少量PBS后，倒置熒光顯微鏡下觀察。

3.3RT-PCR檢測GFAP、nestin、β3- tubulin、MAP-2及MBP mRNA的表達 引物序列見表1。取貼壁分化后的iPSCs, 無菌PBS洗3遍,常規 Trizol法提取總RNA。使用TaKaRa逆轉錄試劑盒，隨機引物逆轉錄合成cDNA后進行PCR擴增，PCR反應條件如下：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增30個循環，72 ℃ 10 min。取9 μL PCR產物于1 μL 10× loading buffer 中，點樣于2%瓊脂糖凝膠電泳，90 V、30 min。紫外燈下觀察，凝膠成像系統(Gel Imaging System)拍照。

表1 引物序列

3.4MAP-2的鑒定 取MAP-2的PCR合成產物，鑒定由上海英濰捷基公司完成。

3.5流式細胞術檢測分化神經干細胞及神經元的比例 細胞經胰酶消化，重懸，400目濾網過濾，每106個細胞經PBS洗滌后使用250 μL固定破膜劑(BD cytofix/cytoperm)，4 ℃孵育20 min。洗滌液清洗細胞2次(BD perm/wash buffer)，每次700×g離心8 min。加入FITC標記的nestin抗體(1∶200)和MAP-2抗體(1∶1 000)，室溫孵育30 min。檢測神經元比例的細胞中繼續加入FITC標記的驢抗兔Ⅱ抗(1∶200)，室溫孵育15 min。吸除抗體，PBS重懸后上機(BD Biosciences)檢測。

結 果

1 小鼠iPSCs形態特點及定向分化為NSCs

小鼠iPSCc呈典型的克隆狀生長(圖1A)。克隆呈圓形或類圓形，邊界清晰?？寺燃毎帕芯o密，核大、核仁清晰，細胞核/質比高，高倍鏡下形似鳥巢。一般在消化iPSCs后懸浮培養的第2天可見到EB形成 (圖2A1、A2)，EB內細胞間黏附緊密，各EB邊界清楚，表面不光滑，胚體飽滿，懸浮生長于培養液中。將EB置于含RA的培養基后其形態無明顯變化，仍呈現圓形或類圓形的懸浮體(圖2A3)；EB貼壁2～3 d后可以觀察到其邊緣逐漸有細胞“爬出”，形成rosette結構(圖2B1)，其細胞形態與iPSCs明顯不同，細胞體積較小，核仁不大，核漿比較低，隨著時間的延長，其分化細胞數目逐漸增多，至第7天達到高峰(圖2B2、B3)；在解剖顯微鏡下經巴氏管機械分離“爬出”的“碎片”狀細胞集落或單個細胞經懸浮培養2 d后，細胞逐漸聚集，再次形成圓形或類圓形的懸浮細胞聚集體，即神經球，其折光性好，內部結構清晰，呈顆粒狀，與EB形態差異較大(圖2C1～C3)。

Figure 1. Charicteristics and identification of the mouse iPSCs. A: photomicrographs of the iPSCs; B～E: stem cell markers were assessed by immunofluorescence, including Sox2 (B), Oct4 (C), SSEA1 (D), and alkaline phosphatase (ALP; E). Scale bars = 200 μm.

2 小鼠NSCs定向分化為神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞

懸浮培養的神經球貼壁培養3～5 d后即可見有神經突起樣的細胞逐漸由其邊緣爬出(圖2D1)，7 d后，可觀察到明顯的神經突起樣結構從貼壁的神經球中伸出，突起相互交織，形成網絡；繼續誘導培養，突起樣結構繼續增多并延長，向遠處遷移，彼此間形成突觸樣結構(圖2D2)，15 d后高倍鏡下見神經元胞體透亮度明顯降低，神經元趨于老化(圖2D3)。

3 iPSc及其分化細胞上特異性表面標志物的表達

iPSc細胞株堿性磷酸酶檢測均為強陽性，呈紫紅色，飼養層細胞不著色，說明iPSCs具有較高的干細胞特性(圖1E)。免疫熒光結果顯示穩定傳代后的iPSCs表達干細胞標志物Oct4、Sox2和SSEA1(圖1B～D)；RA誘導后無血清培養基篩選培養7 d的神經球克隆表達NSCs標志物nestin(圖3A)。神經球貼壁分化培養后的細胞表達神經元標志物(圖3B)、星形膠質細胞標志物GFAP(圖3C)和少突膠質細胞標志物MBP(圖3D),證實神經干細胞已分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。

Figure 3. Immunofluorescence of mouse neurospheres and their differentiated derivatives. Neurospheres, neurons, oligodendrocytes, and astrocytes were assessed by immunofluorescence for nestin (A), MAP-2 (B), GFAP (C), and MBP (D). Scale bars =200 μm (A, C), 100 μm (B), and 50 μm (D).

4 神經球貼壁分化后GFAP、nestin、β3-tubulin、MAP-2和MBP mRNA測定及MAP-2基因的鑒定

RT- PCR結果顯示神經球貼壁分化培養后的細胞分別表達神經元及膠質細胞標志物GFAP、β3-tubulin、MAP-2、和MBP，未表達神經干細胞標志物nestin(圖4A)，表明神經干細胞已完全分化；基因鑒定結果顯示MAP-2 PCR產物與GenBank基因庫中小鼠MAP-2基因相符合(圖4B)。

Figure 4. Sequencing result of MAP-2 gene RT-PCR product in the cells differentiated from the mouse iPSC-derived neurospheres.

5 流式細胞術檢測細胞比例

流式細胞術檢測結果顯示分化細胞中神經干細胞和神經元的比例分別為(63.93±1.47)%和(21.40±1.70)%，見圖5。

Figure 5. Flow cytometric analysis of the markers nestin and MAP-2 in the differentiated cells.

討 論

目前對于神經系統損傷性及退行性疾病，臨床上尚無安全有效的新方法，而再生醫學的快速發展為此類疾病的治療提供了新希望[10]，iPSCs作為再生醫學中一個新興的成員，它的相關理念與技術在數年間迅猛發展，其應用前景也越來越廣闊[11-12]。利用iPSCs的多能分化性可將其定向分化為NSCs及神經元，而NSCs可塑性較強，移植入神經組織中根據局部的信號刺激可分化為神經元及膠質細胞，從而發揮重建信號轉導通路進而恢復神經功能的作用[6-7, 9]，有望成為治療脊髓損傷新興的種子細胞。

本實驗充分證明了體外合適的誘導環境可以將iPSCs定向分化為NSCs及神經元，從而為iPSCs潛在治療效能的實現奠定了基礎。我們在iPSCs向NSCs定向分化后，采用機械分離法將rossette結構外圍的細胞集落盡量分散成碎片或單個細胞，簡化了操作。因在解剖顯微鏡下操作，故需注意無菌原則，同時需細致分離以避免細胞污染。我們在實驗中加用了經典的神經誘導劑RA，其在神經細胞的發育、再生和維持中發揮重要的作用，它能夠抑制前部轉錄因子的表達，同時激活后部轉錄因子的表達[13]。

本實驗所用iPS為病毒誘導而來，其本身存在潛在的致瘤風險，未在動物體內行移植檢測是不足之處，后續實驗擬使用安全性更高的穿膜蛋白[14]誘導iPSCs，并行神經細胞定向分化以及體內實驗驗證。我們在iPSCs定向分化過程中經過了EB中間狀態，而Hester等[9]使用神經源素2(neurogenin 2, NGN2)、胰島素基因增強結合蛋白1(islet-1, ISL-1)和LIM/同源框蛋白3(LIM/homeobox protein 3, LHX3)從iPSCs誘導至神經前體細胞(neural progenitor cells, NPCs)再定向分化為運動神經元(motor neurons, MN)，不經過EB中間狀態。另有研究顯示在不同的誘導條件跳過iPSCs和NSCs過程直接將小鼠和人的成纖維細胞分別重編程為多巴胺能神經元和脊髓運動神經元[15-16]，均簡化了誘導過程。但iPSCs或成纖維細胞分化而來的神經元修復脊髓損傷的作用仍需進一步動物實驗以及未來臨床實驗證明，同時仍需優化誘導條件及流程，使得iPSCs真正成為修復脊髓損傷的理想種子細胞。

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