miR-193通過細胞周期相關(guān)蛋白調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力*

毛晨熙， 陸 地， 孫成超

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科，浙江 溫州 325000)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)因其取材方便、無免疫排斥反應(yīng)、具有多向分化潛能等優(yōu)勢而成為再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點種子細胞[1]。干細胞治療臨床前研究表明，移植細胞的數(shù)量、種類，及移植的時間是制約干細胞治療療效的關(guān)鍵[2]。因此，如何在短時間內(nèi)獲得更多的干細胞成為干細胞應(yīng)用于臨床的一個關(guān)鍵因素。

MicroRNA是一種由20～23個核苷酸片段構(gòu)成的短片段RNA，能通過抑制靶蛋白mRNA的表達及促進其降解發(fā)揮作用[3]。在干細胞領(lǐng)域較多的microRNA被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控細胞增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用[4]。因此，本研究將集中探究microRNA-193 (miR-193)在MSCs增殖過程中的功能，及其可能的作用通路。

材 料 和 方 法

1 動物

實驗動物為SPF級SD大鼠，雄性，體重為60～80 g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，本實驗經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實驗委員會批準。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Invitrogen，siPORT NeoFX Transfection Agent及TaqMan MicroRNA Assay系統(tǒng)均購自Ambion，miR-193轉(zhuǎn)染片段和抑制劑購自上海GenePharma，MTS檢測試劑盒和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega，BrdU增殖檢測試劑盒購自Calbiochem，Ki-67抗體購自Abcam，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物公司，Trizol試劑購自Invitrogen。

3 主要方法

3.1MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取60～80 g SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡3～5 min，取股骨、脛骨，PBS洗去殘留血液。剪去股骨、脛骨兩端骨骺，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔中細胞，接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)。原代培養(yǎng)48 h換液1次，細胞達80～90%時1∶3傳代，3～4代細胞用于本實驗。采用流式細胞術(shù)鑒定MSCs表面抗原類型。

3.2miR-193及其抑制劑轉(zhuǎn)染 MSCs密度達60%～70%時分別轉(zhuǎn)染miR-193片段(pre-miR-193)或其陰性對照(miRNA mimic)以及miR-193抑制劑(anti-miR-193)或其陰性對照(miRNA inhibitor),miRNA mimic和miRNA inhibitor組作為陰性對照組(NC-mim和NC-inh)，轉(zhuǎn)染終濃度為30 nmol/L，轉(zhuǎn)染后24～72 h進行相關(guān)檢測。轉(zhuǎn)染一般步驟參見siPORT NeoFX Transfection Agent(Ambion)轉(zhuǎn)染說明書。熒光染色和qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。相關(guān)miRNA序列見表1。

表1 miRNA序列

3.3MTS細胞增殖檢測 MSCs經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理，分別取轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h的細胞，將其接種到96孔板上，再加入20 μL MTS，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長，測定各孔吸光度。

3.4BrdU細胞增殖檢測 將MSCs接種到96孔板，經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染24 h后，每孔細胞中加入20 μL BrdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進行檢測。

3.5細胞免疫組化染色 將經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理后的各組MSCs接種到蓋玻片上，4%多聚甲醛固定20 min，0.3%Triton X-100孵育10 min，再用1%BSA封閉20 min，加入Ki-67(1∶200)4 ℃下孵育過夜。用PBS浸洗3次后，加入FITC標記的II抗工作液37 ℃孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

3.6Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理后MSCs，在低血清DMEM培養(yǎng)液里培養(yǎng)48 h后收集細胞，Annexin V/PI染色后經(jīng)流式細胞儀檢測，以區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡/壞死細胞(分別標記為Annexin V-/PI-、Annexin V+/PI-、Annexin V+/PI+)。

3.7細胞周期相關(guān)蛋白mRNA表達檢測 將經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理的各組MSCs按試劑盒中方法進行總RNA提取，檢測A260/A280以判定RNA純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量，再進行qRT-PCR檢測。相關(guān)引物序列見表2。

表2 引物序列

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間的差別采用單因素方差分析進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MSCs鑒定結(jié)果

流式細胞技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的MSCs表面抗原結(jié)果，CD29陽性率99.64%，CD44陽性率97.97%，CD34陽性率只有6.25%，CD45陽性率僅為3.35%，符合已知的MSCs表面抗原特點，表明本實驗所使用細胞確為大鼠MSCs，見圖1。

Figure 1. Flow cytometry analysis was used to evaluate surface antigen expression in MSCs.

2 miR-193轉(zhuǎn)染細胞的效率檢測

構(gòu)建短片段miR-193對MSCs進行轉(zhuǎn)染。攜帶熒光的miR-193片段能較好的轉(zhuǎn)染MSCs，熒光發(fā)光比例能達到70%以上，見圖2A。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-193或其抑制劑分別顯著增加或抑制MSCs中miR-193的表達量(均P<0.01),見圖2B。

3 miR-193對MSCs增殖水平的影響

3.1MTS檢測MSCs增殖能力變化 在MSCs轉(zhuǎn)染miR-193后24 h、48 h及72 h分別與對照組相比，MSCs增殖能力顯著增高，抑制miR-193的表達則能造成MSCs增殖能力的下降，以24 h和72 h最為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，見圖3。

3.2BrdU檢測MSCs增殖能力變化 miR-193能夠顯著改變轉(zhuǎn)染24 h后MSCs的增殖狀態(tài)，過表達miR-193促進MSCs的增殖，而抑制miR-193則能夠抑制MSCs的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),見圖4。

3.3細胞大體變化及Ki-67染色 采用Ki-67染色來明確miR-193轉(zhuǎn)染后MSCs核增殖狀態(tài)的變化，并在大體上對細胞的生長狀態(tài)進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-193能增加Ki-67染色陽性細胞數(shù)，而抑制miR-193表達則會造成陽性細胞的減少，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖5。

Figure 2. Transfection efficiency of miR-193 in MSCs.A: transfected MSCs with FAMTM dye-labeled miR-193 for 2 days (scale bars: 50 μm);B: the miR-193 expression detected by qRT-PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NC-mim or NC-inh.

Figure 3. miR-193 regulated proliferation of MSCs at different time points. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NC-mim or NC-inh.

Figure 4. Effect of miR-193 on the proliferation of MSCs detected by BrdU incorporation assay after transfection for 24 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NC-mim or NC-inh.

以上結(jié)果通過3種不同的方法，從不同層面證明了miR-193能夠增強大鼠MSCs的增殖能力。

4 miR-193對MSCs凋亡水平的影響

miR-193抑制組的早期凋亡率要略低于對照組和過表達組，但各組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而miR-193過表達組的晚期凋亡水平要略高于對照組和抑制組，但各組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

5 miR-193調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白的表達

MSCs過表達miR-193能增加細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2, CDK2)mRNA的表達，相反抑制miR-193則下調(diào)CDK2 mRNA的表達(P<0.01)。此外，miR-193僅引起CDK2的表達改變，對于其它細胞周期相關(guān)蛋白的表達則沒有顯著影響，見圖7。

Figure 5. Effect of miR-193 on the proliferation of MSCs detected by Ki-67 immunostaining (scale bars: 50 μm). Green fluorescence indicates Ki-67-positive cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs NC-mim or NC-inh.

Figure 6. miR-193 couldn’t regulate the apoptosis of MSCs. Apoptosis of MSCs was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.

討 論

早在1960年，Hayflick就通過體外細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)MSCs與其它體細胞一樣具有有限的增殖能力，這一現(xiàn)象被譽為Hayflick現(xiàn)象[5]。近期也有研究表明小鼠和人類的MSCs在長期的細胞培養(yǎng)過程中，它們的增殖能力隨著代數(shù)的增加而減少[6]。如何提高MSCs的增殖能力對于提高細胞治療的療效起著重要的作用。

部分miRNA被發(fā)現(xiàn)與干細胞增殖能力相關(guān)，如在胚胎干細胞中敲除Dicer或Dgcr8這2種對于miRNA合成至關(guān)重要的酶，將導(dǎo)致胚胎干細胞增殖能力的明顯降低；而miR-290家族則被證明能夠促進胚胎干細胞增殖[7]。本研究通過對miR-193的過表達和抑制實驗，使用3種檢測方法，從不同層面證實miR-193能顯著改變MSCs的增殖能力。為明確miR-193過表達后MSCs數(shù)量的增多是否是由miR-193對MSCs凋亡水平的調(diào)控引起的，本研究又通過流式細胞技術(shù)證明miR-193不影響MSCs的凋亡水平。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能調(diào)控大量的細胞周期因子，進而調(diào)控細胞增殖[8]。在本研究中，使用qRT-PCR技術(shù)檢測MSCs中部分細胞周期相關(guān)蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)過表達miR-193能顯著升高CDK2的表達水平。而CDK2在細胞增殖過程中起著關(guān)鍵作用，CDK/cyclin復(fù)合物能夠調(diào)控細胞由G1期進入S期的過程[9]，這一過程的長短正是細胞增殖能力強弱的表現(xiàn)[10]。另有文獻報道，CDK2可能通過改變?nèi)祟惣毎麑毎L因子的應(yīng)答能力來調(diào)控細胞周期的轉(zhuǎn)變，進而調(diào)控細胞的增殖能力[11]。因此推測miR-193調(diào)控MSCs增殖能力的功能可能是通過調(diào)控CDK2的表達來實現(xiàn)的。

Figure 7. Effects of miR-193 on the mRNA expression of cell cycle-related proteins in MSCs detected by qRT-PCR. CCNA2:cyclin A2；CCNB1:cyclin B1；CDK2: cyclin-dependent kinase 2; CCND1:cyclin D1；CCNE1:cyclin E1.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NC-mim or NC-inh.

綜上所述，miR-193可能通過增強CDK2的表達，最終上調(diào)MSCs的增殖水平。

[參 考 文 獻]

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