韓澤平, 何金花, 黎毓光

(番禺區中心醫院檢驗科，廣東 廣州 511400)

糖尿病是一種因體內胰島素絕對或者相對不足所導致的一系列臨床綜合癥，可分為4種類型：1型糖尿病、2型糖尿病、其它特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病。根據我國2010年全國糖尿病流行病學調查[1]，20歲以上的成年人中有11 390萬人患有糖尿病，患病率高達11.6%，前期人群達到50.1%，其中2型糖尿病占90%以上。全世界糖尿病人數正以每年6%的速度遞增，估計到2025年，我國患糖尿病人數將達3億之多[2]，嚴重影響人類的生命健康和社會發展。因此，尋找糖尿病的病因及發病機制成為當今研究的熱點。

隨著基因組計劃的完成,以及人們對糖尿病研究的不斷深入，已有大量研究證明微小RNA (microRNA,miRNA)廣泛參與糖尿病的發生與發展，然而關于長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)與糖尿病關系的研究卻處于接近空白狀態。本文就lncRNA在糖尿病發生與發展過程中的研究作一綜述。

1 LncRNA概述

LncRNAs是一類轉錄本長度超過200核苷酸單位(nt)的功能性RNA分子，它們位于細胞核或胞質內，缺乏編碼蛋白質的能力，以RNA形式在表觀遺傳水平、轉錄水平及轉錄后水平等多種層面上調控基因的表達，廣泛參與機體幾乎所有的生理和病理過程，與臨床上多種疾病關系密切[3]。雖然目前被發現的lncRNA數量逐漸增多，但對其在生命活動中的具體調控機制及功能模式仍不清楚。據報道，lncRNA在一些復雜疾病(如癌癥、神經系統疾病和糖尿病等)的發生過程中異常表達，具有促使或抑制疾病發生的作用[4]。因此，研究lncRNA 對于認識生命體復雜而多層次的調控體系、提高人類預防和治療疾病的能力以及探索生物進化規律等都具有積極的生物學意義。

1.1LncRNA的結構 目前，對lncRNA的來源存在多種說法，普遍認為：(1)染色質重組的結局；(2)編碼蛋白質的基因結構發生中斷而轉變成lncRNA；(3)非編碼基因復制過程中的反移位產物；(4)局部的串聯復制子鄰近產生；(5)基因組中插入1個轉座成分而產生有功能的非編碼RNA[5]。根據轉錄基因與鄰近的蛋白編碼基因的位置，可將lncRNA分為5種類型：(1)正義lncRNA：其轉錄方向與鄰近蛋白編碼基因轉錄方向相同；(2)反義lncRNA：其轉錄方向與鄰近蛋白編碼基因轉錄方向相反；(3)雙向lncRNA：lncRNAs可同時從與鄰近的蛋白編碼基因轉錄相同、相反2個方向發生轉錄；(4)基因內lncRNA：lncRNAs從基因的內含子區轉錄得到；(5)基因間lncRNA：lncRNAs從2個基因的基因間轉錄得到[5]。與編碼RNA相比，lncRNA的保守性較差，然而在其分子內部，卻含有較為保守的序列，且其表達具有重要的生理生化功能。LncRNA像mRNA一樣由RNA聚合酶Ⅱ生成，通過計算機分析發現lncRNA只有很少的起始密碼子和閱讀框，并且lncRNA在結構特點和序列組成方面和編碼蛋白質RNA的3’非翻譯區域(3’untranslated regions, 3’UTR)相似，其表達具有明顯的組織和時空特異性[6]。

1.2LncRNA的作用機制 LncRNA可通過各種分子機制在X染色體失活、基因印跡、染色體修飾、轉錄、翻譯、蛋白質的活性調控以及RNA的可變剪切調控等過程中發揮著重要的調節作用。目前，lncRNA參與各種疾病的作用機制尚未明確，總結近年研究，lncRNA在分子水平上的功能主要有以下幾個方面[7]，如圖1所示：(1)通過在蛋白編碼基因上游啟動子區(橙色)發生轉錄，干擾下游基因(藍色)的表達；(2)通過抑制RNA聚合酶Ⅱ或者介導染色質重構以及組蛋白修飾，影響下游基因(藍色)表達；(3)通過與蛋白編碼基因的轉錄本形成互補雙鏈(紫色)，進而干擾mRNA剪切，從而產生不同的剪切形式；(4)通過與蛋白編碼基因的轉錄本形成互補雙鏈(紫色)，進一步在Dicer酶作用下產生內源性siRNA，調控基因的表達水平；(5)通過結合到特定蛋白質上，lncRNA轉錄本(綠色)能夠調節相應蛋白的活性；(6)作為結構組分與蛋白質形成核酸蛋白質復合體；(7)通過結合到特定蛋白上，改變該蛋白的胞質定位；(8)可加工產生小分子RNA(紅色)，作為小分子RNA如miRNA、Piwi蛋白相作用RNA(Piwi-interacting RNA, piRNA)和肺腺癌轉移相關轉錄本1相關胞漿小RNA(MALAT1-associated small cytoplasmic RNA, mascRNA)的前體分子轉錄。

Figure 1. Mechanisms of the effects of lncRNA [Genes Dev, 2009, 23(13): 1494-1504].

1.3LncRNA的組織特異性 有研究證明，78%的lncRNA具有組織特異性，本特征對其在疾病發生中的作用有很重要影響[8]。在疾病的發生和發展中，不同組織之間的lncRNA表達量不同，肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)和肝癌高表達轉錄本(highly up-regulated in liver cancer,HULC)在正常肝細胞中含量極低，肝癌發生時表達明顯上升[9-10]。研究發現，在人體正常組織中，除了前列腺組織可低表達前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)外，其它組織中均未發現其表達，然而它在前列腺癌組織中卻呈高特異性表達狀態[11]。因此，PCA3基因的表達具有很高的組織特異性和癌特異性，被認為是目前前列腺癌最特異的基因[12]。Morán等[13]重新排列16例人類非胰島RNA序列數據集，發現9.4%的參考序列(reference sequence, RefSeq)數據庫有注釋的基因為胰島所特有。小島lncRNAs通常定位于胰島特異的核染色質區域和編碼基因的附近，其中55%的基因間lncRNAs和40%反義胰島lncRNAs具有胰島特異性，推測人類的胰島細胞lncRNA是以高度組織特異模式轉錄的。

2 LncRNA與糖尿病的關系

失調的lncRNA可通過多種途徑在疾病的發生和發展中發揮重要作用。目前，相關研究發現lncRNA細胞周期激酶抑制因子4(INK4)位點的反義編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus, ANRIL)、葡萄胎相關印跡基因(hydatidiform mole associated and imprinted, HYMAI)、胰島素樣生長因子2反義RNA(insulin-like growth factor 2 antisense RNA, IGF-2AS)、母系表達基因3(maternally expressed gene,MEG3)、漿細胞瘤變體易位基因1(plasmacytoma variant translocation 1 gene,PVT1)和HI-LNC25與糖尿病密切相關，這些lncRNAs通過表達的異常、甲基化和基因多態性等多種途徑廣泛參與糖尿病的發生與發展，見表1。

表1 與糖尿病相關的lncRNA

2.1ANRIL ANRIL又稱細胞周期依賴激酶抑制劑2B 反義RNA(cyclin-dependent kinase inhibitor 2B antisense RNA,CDKN2BAS)或p15反義RNA (p15 antisense RNA,p15AS)。體外過表達ANRIL可在表觀遺傳學水平引起p15基因表達沉默。ANRIL的異常表達和單核苷酸多態性與包括糖尿病在內的一些疾病有關。胰島素依賴性蛋白激酶抑制因子2B(CDKN2B或p15)基因位于9號染色體9q21，編碼表達于胰島細胞中的p15細胞周期激酶抑制因子4b蛋白(p15INK4b)。ANRIL轉錄物與p15INK4b有很好的相關性，尤其在全血中，ANRIL能夠直接影響p15INK4b的表達[14]。p15INK4b是一種周期依賴性激酶抑制劑，通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)阻礙細胞G1進入S期的進程。動物模型研究顯示p15INK4b的過表達可引起小鼠胰島發育不全并出現糖尿病癥狀[15]。由于ANRIL是CDKN2B的反義RNA,我們猜測ANRIL通過抑制CDKN2B的表達，從而引起p15INK4b低表達而導致糖尿病，但此推理與上述研究不符，可能是因為上述研究是基于表觀遺傳學上的，而ANRIL與糖尿病的關系可能更復雜，推測與其多態性有關。研究發現，糖尿病風險單核苷酸多態性與ANRIL的等位基因密切相關，CDKN2B基因上游約125 kb的基因組非編碼區存在多個2型糖尿病的風險位點[16]。Cunnington等[17]報道，下調ANRIL的表達可導致糖尿病在內的多種人類疾病的發生，證實糖尿病相關風險變體(rs10811661-T和rs2383208-A)與ANRIL表達量的下降相關。另外，他們還發現在基因多態性上，ANRIL與CDKN2B的表達相反，這證明了ANRIL的反義轉錄物能調控抑制CDKN2B的表達。Zeggini等[18]分析對比糖尿病病人與正常人群的基因，發現糖尿病的易感基因在CDK5調節亞基蛋白1樣蛋白1(CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like protein 1,CDKAL1)、胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2,IGF2BP2)和CDKN2A/CDKN2B這3個基因的內部和周圍，并認為ANRIL與2型糖尿病確實存在聯系，但具體的致病機制尚未明確。

2.2HYMAI 與大多數lncRNAs一樣，HYMAI編碼非蛋白轉錄物，但只表達于父源等位基因中，且在兩個父母等位基因的相鄰CpG島中顯示特異性DNA甲基化[19]。目前其相關功能尚不明確，最近報道認為HYMAI與新生兒糖尿病(neonatal diabetes mellitus, NDM)相關。NDM是出生后6個月內發生的糖尿病，是一種較少見的特殊類型糖尿病，根據臨床特點及轉歸不同，可分為新生兒暫時性糖尿病(transient neonatal diabetes mellitus, TNDM)和新生兒永久性糖尿病(permanent neonatal diabetes mellitus, PNDM)2種類型[20]。遺傳學研究表明，TNDM大多與父源性6號染色體上的基因復制和轉錄過程中發生突變有關，提示6q24有與TNDM密切相關的印跡基因，由于其配子來源不同具有異于其等位基因的表達。研究發現，位于6q24的2個重疊印跡基因鋅指蛋白(zinc finger protein which regulates apoptosis and cell cycle arrest,ZAC)和HYMAI的母源性甲基化缺陷與TNDM相關[21]。ZAC是父源印跡基因，廣泛編碼鋅指蛋白，促進細胞凋亡和細胞更新。ZAC過表達可導致TNDM，Du等[22]通過體外過表達ZAC基因，證實了ZAC是β細胞對血糖調節的負性基因，它可通過增加鈣離子濃度介導血糖刺激胰島素分泌功能受損，致使胰島素的遲發分泌。另外，ZAC也可調節垂體腺苷酸環化酶活化多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)受體1的表達[23]。PACAP是一種非常有效的胰島素促分泌素，可作用于胰腺PACAP受體1。ZAC的過表達有可能以某種未知的方式改變正常胰島細胞對PACAP的反應而導致血糖的異常。由于ZAC和HYMAI基因部分重疊，并共用一個母源甲基化CpG島[24]，我們猜測HYMAI導致TNDM的發病機制可能與ZAC相似。人類ZAC/HYMAI位于6q24-q25，TNDM與該區父源復制及ZAC/HYMAICpG島異常甲基化有關。Gardner等[25]指出ZAC和HYMAI異常表達的TNDM患者都患有甲基化缺陷，他們發現TNDM患者皮膚纖維原細胞的ZAC和HYMAI單等位基因表達松弛。這一現象提示這2個未甲基化等位基因的存在與毗鄰基因不適當表達有關。Ma等[24]通過建立動物模型實驗發現，人類ZAC和HYMAI都是經由父源傳遞，在胰腺B細胞和視丘下部等位置表達，具有調節葡萄糖動態平衡的潛在功能。特別是在父源傳遞基礎上遺傳得到高拷貝數的轉基因引起了血糖和尿糖的增加。但這些遺傳學異常與胰島素分泌細胞功能異常之間的確切聯系還需進一步闡明。

2.3IGF-2ASIGF-2AS表達于父源等位基因，廣泛存在于各種組織中，是一個IGF-2的反義印跡基因。IGF-2AS由3個外顯子組成，其中包含胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2,IGF-2)基因的折疊外顯子4和3(IGF-2基因共有9個外顯子)，因此其與IGF-2基因共享某些基因組區域[26]。人類IGF-2AS缺乏一個中心重復序列，但存在一個獨特的轉錄起始位點[27]。據報道，IGF-2和IGF-2AS可作為多種重要疾病的候選基因，包括癌癥、肥胖、高血壓、冠心病和糖尿病等[27-28]。目前，人們對IGF-2AS的研究多在腫瘤學方面，而對在糖尿病方面的研究甚少。Mutskov 等[28]報道，用高濃度葡萄糖刺激胰島β細胞，可使IGF-2AS表達量上調，證實了血糖的濃度是影響IGF-2AS基因表達的主要調節因素，但具體機制尚未明確。

2.4MEG3MEG3是一種印跡基因，位于14號染色體14q32區域，只在母源等位基因上表達，受到印跡控制區(imprinting control regions,ICRs)的嚴格調控。ICRs的基因或表觀基因學的改變都會導致正常表達的等位基因的表達沉默，或者激活正常沉默的等位基因，這種現象稱為印跡丟失(loss of imprinting, LOI)，LOI被認為和人類許多疾病有關。MEG3廣泛表達于多種組織中，且在垂體、腦組織、胎盤、腎上腺、卵巢和胰腺中高表達，提示它可能和神經內分泌功能相關[29]。據報道，MEG3在多種腫瘤性疾病中表達水平降低或缺失，異位表達MEG3可抑制不同種類的人類癌細胞系的生長[30],推測MEG3的功能失活與腫瘤的發展相關。然而，目前對MEG3的功能尚不完全清楚，特別是對其在糖尿病中發揮的作用還知之甚少。研究發現，與1型糖尿病相關性最強的敏感位點位于14號染色體14q32.28的一個完整印跡區域，標記為SNP rs941576。SNP rs941576恰恰定位在母系表達的非編碼RNA MEG3的第6內含子內[31]，提示了MEG3與糖尿病相關。Wallace等[31]建立動物模型實驗，在小鼠的差異甲基化區域的下游插入一個轉基因，引起了父源染色體上的印跡丟失，小鼠的等位基因MEG3、基因捕獲位點2(gene trap locus 2,GTL2)的表達和跨膜蛋白delta-like 1(delta-like 1 homolog,DLK1)的表達量下降，他們認為MEG3這個母系表達SNP可以調節父源性表達的DLK1和逆轉錄轉座子樣1(retrotransposon-like 1,RTL1)基因的表達，從而導致1型糖尿病的發生與發展。Zhao等[32]在用去甲基化的藥物對這些腫瘤進行治療后，發現這些細胞中出現了MEG3的表達，說明在MEG3基因功能調節區域的DNA甲基化和MEG3在腫瘤中表達丟失密切相關。已證實，DLK1/MEG3的ICR是基因間差異甲基化區域，即在父源性的相應染色體片段上是被甲基化的[33]。由此，我們推測，MEG3的甲基化可能是1型糖尿病的發病機制之一。閱讀相關文獻，我們發現與良性人肝細胞相比，在肝癌細胞株中的lncRNAMEG3表達顯著下調，并認為這是miR-29a調控MEG3啟動子產生超甲基化所引起的[34]。另有研究構建大鼠2型糖尿病模型，發現了miR-29a在3種胰島素作用組織(肌肉、脂肪、肝組織)中均呈上調狀態，高水平的miR-29a導致細胞對胰島素失敏，和高血糖、高胰島素引起的胰島素失敏相仿，證明了miR-29a在胰島素信號轉導途徑中起調控作用，miR-29a可作為糖尿病的生物標志物[35]。鑒于上述研究，我們推測，miR-29a可能通過某種調控通路參與lncRNA MEG3的甲基化，從而導致糖尿病的發生與發展。

2.5PVT1 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是在發展中國家引起慢性腎衰竭和導致患糖尿病者預期壽命縮短最常見的原因。近年發現PVT1基因與DN密切相關。PVT1位于人類8號染色體8q24區域，由58個腺嘌呤、116個胞嘧啶、131個鳥嘌呤和55個胸腺嘧啶組成，其表達可促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[36]。PVT1在腎臟多種細胞中均呈高表達狀態。Hanson等[37]報道O’odham奧哈姆人群中2型糖尿病的全基因組關聯分析，研究采用Affymetrix 100K芯片，在105例2型糖尿病患者和102例對照者中，發現位于PVT1內含子8中的rs2648875與DN顯著相關，并認為PVT1能提高糖尿病患者罹患終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的機率。Millis等[38]分析531例終末期腎病印第安人和564例患有糖尿病大于20年且尿蛋白肌酐排泄率小于150 mg/g的印第安人的24個PVT1基因分型，經年齡、患糖尿病時間、吸煙等因素調整后，結果顯示DN與1型糖尿病關系密切，其中PVT1 rs13447075和rs2648862與DN所致的ESRD最為相關。Alvarez等[39]發現PVT1可能有助于降低腎臟過濾血液的能力，從而導致腎臟疾病、腎功能衰竭和死亡。在高血糖的狀態下，PVT1的表達水平可增高至原來的5倍。他們通過RNA干擾技術敲除腎小球系膜細胞的PVT1基因，并分別運用qPCR和ELISA技術分析纖連蛋白1(fibronectin 1,FN1)、Ⅳ型膠原蛋白α1 (collagen,type Ⅳ,alpha 1,COL4A1)、轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)的mRNA和蛋白水平。結果顯示，對人系膜細胞進行高糖實驗，使得PVT1的表達顯著上調，與其同時FN1、COL4A1、TGF-β1和PAI-1的水平也上升；最重要的是，PVT1的敲除能顯著地降低各種細胞外基質(extracellular matrix,ECM)成分的mRNA和蛋白水平，而ECM在系膜細胞內的過度堆積是糖尿病腎病的標志。與TGF-β1對比，PVT1導致FN1、COL4A1和PAI-1的分泌水平下降更加明顯，其作用方式至少部分獨立于TGF-β1，表明了PVT1通過ECM的堆積而引起糖尿病腎病的發生和發展。

2.6HI-LNC25 HI-LNC25是一個長約1.6Mb多功能外顯子轉錄物，缺乏蛋白質編碼能力但包含胰島特異性活性染色質簇，研究顯示HI-LNC25具有高度的組織特異性。Morán等[13]建立實驗模型，基于葡萄糖誘導人β細胞株分泌胰島素的原理，將表達2種獨立的shRNA的慢病毒載體轉導入人β細胞中，從而抑制HI-LNC25的表達，同時檢測24組胰島mRNA的表達量。結果顯示，GLIS家族鋅指3(GLIS family zinc finger 3, GLIS3) mRNA為HI-LNC25的潛在靶向調控基因。GLIS3編碼一種胰島轉錄因子，它的突變發生在包括2型糖尿病風險變異位點在內的單基因糖尿病中。雖然降低HI-LNC25的表達沒有顯著地引起β細胞的葡萄糖誘導胰島素分泌，但與另外5組對照shRNA相比，GLIS3 mRNA的表達均被下調，而對照組基因表達量沒有明顯變化，提示了反義lncRNA能調控人類胰島β細胞單基因疾病的蛋白編碼基因。

3 問題與展望

LncRNA的發現使得大量遺傳信息被認知，至2013年10月10日，已發現197種功能性lncRNAs (http：//lncrnadb.com)。但迄今所鑒定的功能性lncRNAs與依據生物信息學手段所推測的數目相比僅僅是冰山一角。LncRNA能夠調節與之相關的蛋白編碼基因，它們的表達不當可能導致疾病的發生，這一發現開拓了對病因學上lncRNA作用機制研究的新領域。綜合上述研究，我們發現，lncRNA可能通過表達的上調或抑制、甲基化、基因多態性等多種途徑參與糖尿病的發生與發展，而在此過程中一個lncRNA可能同時經過多種途徑起作用，也可能是多個lncRNAs共同作用的結果，總之，lncRNA參與糖尿病發病的機制相當復雜，還有待進一步闡明。目前，對lncRNA的研究僅僅處于起步階段，關于lncRNA與糖尿病相關聯的證據并不多，要想使lncRNA成為一種診斷標志，需要進一步確定lncRNA在正常人中的表達水平，以及具有臨床診斷意義的變化程度。通過對lncRNA在疾病中作用機制的研究，可以利用基因敲除、RNA干擾、基因增補、基因滅活等基因手段切斷lncRNAs的致病途徑，為糖尿病提供一種新的治療方法。

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