脂多糖通過PI3K/Akt/mTOR通路調控巨噬細胞自噬*

杜 濤， 黃 海， 陳 欣， 丁 紅， 張 睿， 劉梅蘭， 陳 慧

(中山大學孫逸仙紀念醫院婦產科，廣東 廣州 510120)

巨噬細胞是胚胎免疫耐受的核心細胞，流產患者中巨噬細胞的增多并活化是導致流產的主要因素之一[1]。自噬是溶酶體對自身結構的吞噬降解，它既是細胞內的再循環系統，也是機體一種重要的防御和保護機制。在生理狀態下，自噬作為機體的一種防御機制，在母體對胚胎免疫耐受的發病機制中具有十分重要作用[2]。自噬在對中樞免疫耐受的誘導中起到關健作用。因此研究母體中巨噬細胞的自噬情況及其調控機制對自然流產的發生具有深遠意義。本研究擬通過體外實驗利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬細胞，同時檢測巨噬細胞自噬情況及其經典PI3K/Akt/mTOR調控通路，對流產中母體巨噬細胞自噬的機制進行初步探討。

材 料 和 方 法

1 材料

RPMI-1640培養基和胎牛血清(HyClone)；0.25%胰酶(吉瑪公司)；3-磷酸甘油醛脫氫酶(gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體(Santa)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記羊抗兔抗體(ICL)；BCA法蛋白定量試劑盒(上海申能博采)；柯達黑白膠片；增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒(Thermo),超敏ECL試劑盒(Millipore)。

2 方法

2.1實驗分組 將巨噬細胞體外培養，共分為5組，分別檢測不同狀態下巨噬細胞的自噬情況以及PI3K/Akt/mTOR通路激活狀態；分別從PI3K及mTOR水平阻斷PI3K/Akt/mTOR通路，檢測巨噬細胞自噬，明確巨噬細胞自噬與PI3K/Akt/mTOR之間的關系。A組：單純小鼠巨噬細胞系RAW264.7 細胞；B組：Earle’s平衡鹽溶液培養的巨噬細胞(饑餓狀態，激活自噬)；C組：LPS刺激的巨噬細胞；D組：LPS刺激后的巨噬細胞+PI3K抑制劑(hVps34)；E組：LPS刺激后的巨噬細胞+mTOR抑制劑(雷帕霉素)。

2.2各組巨噬細胞體外培養 小鼠巨噬細胞系RAW264.7 細胞購自American Type Tissue Collection(ATCC)，常規傳代培養，培養基采用含10%胎牛血清的DMEM。C組用LPS刺激巨噬細胞，濃度為1 μg/L。D組和E組分別加入hVps34和雷帕霉素阻斷PI3K/Akt/mTOR通路。

2.3穩定表達GFP-LC3的RAW264.7細胞系的建立 構建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表達載體，應用轉染技術將該質粒導入RAW264.7細胞，用G418篩選穩定表達的細胞系。真核細胞中GFP-LC3的表達分別用熒光顯微鏡檢測，并利用該穩定表達細胞系觀察內質網應激時細胞發生自噬的情況。

2.4檢測各組巨噬細胞自噬情況

2.4.1用qRT-PCR方法檢測細胞自噬相關基因的mRNA表達水平 qRT-PCR采用的是LightCycler Real Time PCR擴增儀。用TRIzol從細胞內提取總RNA。然后用SuperScript試劑盒合成cDNA。Atg5上游引物5’-TTGACGTTGGTAACTGACAAAGT-3’,下游引物5’-TGTGATGTTCCAAGGAAGAGC-3’;Atg7上游引物5’-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3’,下游引物5’-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3’;LC3-Ⅱ上游引物5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’,下游引物5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’;Bnip3上游引物5’-TGGACGGAGTAGCTCCAAGAG-3’,下游引物5’-CCGACTTGACCAATCCCATATC-3’。

預變性：95 ℃ 30 s；PCR反應： 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環40次；熔解曲線分析：95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線。

2.4.2在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白示蹤自噬形成 由于電鏡耗時長，不利于監測自噬形成過程，我們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象對此進行觀察。無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。

2.4.3利用Western blotting檢測LC3-II、p-Akt和p-mTOR的表達 將5組細胞培養后，吸除培養基，冰上RIPA 按70 μL/well，PMSF 按RIPA 的1/100 加入，冰上裂解30 min。刮取裂解細胞于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清為細胞總蛋白。BCA 法蛋白定量，于12%SDS-PAGE 行細胞蛋白電泳，轉于PVDF 膜上，剪取目的條帶，5%脫脂奶封閉3 h，分別孵LC3-II、p-Akt和p-mTORⅠ抗過夜，第2天孵HRP 標記Ⅱ抗1 h，暗室中加入發光液，黑白膠片曝光。所得到免疫印跡的定量可以用Bio-Rad提供的Molecular Analyst software進行灰度分析。計算LC3-II、p-Akt、p-mTOR和內參照GAPDH比值，評價自噬形成及mTOR通路激活情況。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，計量資料采用單因素方差分析或者Kruskal-Wallis檢驗；統計分析軟件使用SPSS 17.0。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 穩定表達GFP-LC3的RAW264.7細胞系的建立

構建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表達載體，應用轉染技術將該質粒導入RAW264.7細胞，用G418篩選穩定表達的細胞系。真核細胞中GFP-LC3的表達用熒光顯微鏡檢測，如圖1所示，可見RAW264.7細胞穩定表達GFP-LC3并在藍光照射下發出綠色熒光。

2 檢測各組巨噬細胞自噬情況

2.1用qRT-PCR方法檢測細胞自噬相關基因的mRNA表達水平 如圖2所示，在5組細胞中，自噬相關基因的表達存在明顯差異，在饑餓狀態下巨噬細胞均處于自噬激活狀態，自噬相關基因Atg5、Atg7、LC3-II和Bnip3的mRNA表達均上升；在LPS刺激下，巨噬細胞的自噬處于抑制狀態，與對照組比，Atg5、LC3-II和Bnip3存在顯著差異，但是Atg7的mRNA水平與對照組沒有明顯差異；加入PI3K抑制劑(hVps34)和mTOR抑制劑(雷帕霉素)后，巨噬細胞的自噬明顯處于激活狀態，與對照組相比，Atg5、 Atg7、LC3-II和Bnip3的mRNA表達均上升。

Figure 1. pcDNA3.1-GFP-LC3 transfected into RAW264.7 cells (×200).A:fluorescence; B: phase-contrast; C: merged.

Figure 2. The mRNA expression of Atg5, Atg7, LC3-II and Bnip3 in each group. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.2在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成 如圖3所示，將GFP-LC3融合蛋白轉入巨噬細胞后，在熒光顯微鏡下可以觀察自噬體的形成。單純巨噬細胞組中GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中，很少形成代表自噬體的熒光斑點；Earle’s平衡鹽溶液中巨噬細胞處于自噬激活狀態，可見自噬體形成；LPS組雖然有自噬體形成，單熒光強度低于Earle’s平衡鹽溶液組；另外2組均可看到較多自噬體的形成，LPS+雷帕霉素組最明顯。除了LPS組與對照組之間沒有明顯差異外，其它各組熒光強度與對照組之間存在明顯差異。

2.3利用Western blotting檢測LC3-II、p-Akt(Ser473)和p-mTOR(Ser2448)的變化 如圖4所示，p-Akt(Ser473)在Earle’s平衡鹽組、LPS組和LPS+雷帕霉素組中表達明顯升高；p-mTOR(Ser2448)在Earle’s平衡鹽組、LPS+hVps34組和LPS+雷帕霉素組表達明顯下降；LC3-II的表達在Earle’s平衡鹽組、LPS+hVps34組和LPS+雷帕霉素組中表達要高于對照組和LPS組。阻斷mTOR后，巨噬細胞自噬增強，這與文獻報道相同，mTOR對細胞自噬起到負調節作用。阻斷PI3K后，在LPS共同作用下，Akt磷酸化水平下降明顯，但是巨噬細胞自噬水平并沒有下降，這與文獻報道不符，應該存在其它相關通路對自噬進行調控。

討 論

在免疫網絡中巨噬細胞既是免疫效應細胞，又是免疫調節細胞[3-4]。(1)正相調節作用：體內的巨噬細胞一般處于靜止狀態，當受到某些因素如病原體等異物或細胞因子等刺激后活化，活化的巨噬細胞功能明顯增強，不但吞噬各種病原體，殺傷腫瘤細胞，而且還向 T 細胞提呈抗原，分泌細胞因子參與免疫應答，該作用稱為免疫正相調節作用。(2)負相調節作用：巨噬細胞中還存在一種抑制性巨噬細胞，分泌多種可溶性抑制物如前列腺素、活性氧分子等抑制淋巴細胞增殖反應或直接損傷淋巴細胞，該作用稱為免疫負相調節作用。抑制性巨噬細胞經 LPS 刺激后發生免疫調節成為新型巨噬細胞，分泌 IL-1、IL-2、PGE 增加，能夠增強 T、B 淋巴細胞及 NK細胞活性，并保持或增強抗腫瘤效應[5]。(3)體內各種因素通過調控巨噬細胞功能狀態而發揮免疫調節作用。多種神經肽及激素樣物質如 P 物質、皮質激素、性激素等均可通過相應受體而調控巨噬細胞的功能狀態；另外，某些神經肽與細胞因子(如 IL-1、TNF-α、IFN-γ)可誘導巨噬細胞 MHC-Ⅱ類抗原的表達，從而調控其抗原呈遞功能[6]。

巨噬細胞是調控母體免疫狀況產生免疫耐受的重要細胞，從而決定胚胎是否可以免受免疫打擊而流產[7-9]。巨噬細胞是天然性免疫和獲得性免疫的橋梁，通過識別并耐受胚胎抗原直接影響妊娠結局，巨噬細胞的功能異常是導致母胎耐受異常、流產發生的重要原因[10-12]，研究已經證明在流產的動物模型及臨床標本中巨噬細胞均處于活化狀態。因此明確巨噬細胞功能狀態對了解流產有重要意義。

Figure 4. Expression of LC3-II, p-Akt and p-mTOR tested by Western blotting.Lane 1: control group; Lane 2: starvation group; Lane 3: LPS group; Lane 4: LPS+PI3K inhibitor (hVps34) group; Lane 5: LPS+mTOR inhibitor (rapamycin) group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs LPS.

細胞自噬是溶酶體對自身結構的吞噬降解，它既是細胞內的再循環系統，也是是機體一種重要的防御和保護機制。巨噬細胞自噬狀態可以影響其具體功能。巨噬細胞可以通過自噬與溶酶體結合，消除、降解和消化受損、變性、衰老和失去功能的細胞、細胞器以及變性蛋白質與核酸等生物大分子。這種機能為細胞的重建、再生和修復提供必須原料，實現細胞內資源的再循環和再利用。在生理狀態下，自噬作為機體的一種防御機制，在母體對胚胎免疫耐受的發病機制中具有十分重要作用。自噬在對中樞免疫耐受的誘導中起到關健作用。首先，自噬相關基因Atg5缺陷的胸腺移植可導致自身反應性CD4+T細胞的產生[13]；其次，自身免疫性腸病——克羅恩氏病的發生部分歸因于自噬相關基因Atg16L1的多態性[14]。然而，自噬在外周免疫耐受中的作用，目前尚無直接可用的實驗數據對其論證，但存在一些間接證據可以對其佐證。例如：來源于自噬相關基因Atg16L1缺陷的巨噬細胞經內毒素刺激后可產生更多的前炎癥細胞因子(IL-1β和IL-18)[15]。因此，自噬狀態關系到巨噬細胞的功能，在流產孕婦中間接關系到免疫狀態，從而對胎兒產生影響。

mTOR是調節細胞生長和增殖的重要因子，在與營養分子有關的信號轉導、蛋白質翻譯調控、細胞周期進展等過程中都占據重要地位；同時，它也是自噬啟動階段的關鍵調節因子，活化后可抑制自噬發生[16-17]。啟動階段的靶點主要為mTOR相關靶點，包括TOR 復合體1 (TOR complex 1， TORC1)和Ⅰ型PI3K。(1) TORC1：mTOR由2個獨立的復合體-TORC1和TORC2構成。細胞內生長因子的信號及能量水平和營養狀態的信息會通過Ⅰ型PI3K和Akt/PKB通路傳遞給TORC1，并在達到適當的水平時導致TORC1活化，從而激活mTOR，使自噬受到抑制。故而，可通過調節TORC1 的活性來影響mTOR的活性，進而調節細胞自噬的活性。最經典的自噬相關藥物-雷帕霉素的作用靶點即為TORC1[18]。我們的實驗證實，加入雷帕霉素后巨噬細胞中的自噬明顯增強。(2) Ⅰ型PI3K：活化的生長因子受體可通過直接結合的方式來激活下游的Ⅰ型PI3K；也可通過生長因子受體結合蛋白2 (growth factor receptor-bound protein 2, GRB2)和SOS (Son of sevenless) 介導激活Ras，再由Ras間接激活Ⅰ型PI3K。但無論采用哪種方式, 激活Ⅰ型PI3K從而觸發mTOR通路是必不可少的環節，因而通過對Ⅰ型PI3K的調控就可起到對自噬進行調控的作用。我們加入經典的自噬抑制藥物hVps34后，巨噬細胞的自噬并沒有明顯下降，這證明LPS對巨噬細胞的作用還存在其它的信號通路。LPS刺激巨噬細胞后，通過免疫熒光及Western blotting均可檢測到巨噬細胞的自噬有所增加，考慮是外界因素刺激巨噬細胞后，細胞本身產生的保護機制。而加入hVps34后，細胞內自噬反而增加主要因為抑制了傳統自噬調控通路mTOR后，側枝通路調控加強所引起，同時協同LPS對細胞的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)的激活，各方效果疊加后巨噬細胞的自噬反而增強。因此，LPS可以調控巨噬細胞的自噬，其可能的調控通路為PI3K/Akt/mTOR通路，但這不是唯一通路。

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