硫化氫對高糖誘導的小鼠足突細胞損傷的影響*

劉 曄， 彭 力， 盧圣霞， 杜月娟， 劉元濤△， 傅余芹△

(山東大學第二醫院 1腎臟內科， 2內分泌科，山東 濟南 250033；3山東電力中心醫院內科，山東 濟南 250002; 4濟南市中心醫院腎臟內科，山東 濟南 250013)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發癥之一，也是糖尿病致死致殘的重要原因。近年的研究表明，足突細胞損傷在糖尿病腎病的發生尤其是蛋白尿的形成過程中具有關鍵作用[1]。Wnt/β-catenin是細胞內高度保守的信號通路，參與腎臟在胚胎階段的發生發育。目前研究發現，在成人腎臟病，包括急性腎損傷、腎小球疾病、糖尿病腎病等，該途徑被異常激活并參與足突細胞損傷的病理過程[2]。緊密連接蛋白2(zonula occludens-2，ZO-2)屬于膜相關鳥苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinase 3β，MAGUK)蛋白家族成員，作為骨架蛋白其廣泛存在于體內上皮細胞的緊密連接處及增殖期細胞核內，參與多種途徑的信號轉導。已有研究發現ZO-2存在于腎小球足突細胞中，氧化應激反應可能影響其表達并可能參與調控Wnt/β-catenin通路[3]。

硫化氫(H2S)是繼一氧化碳(carbonic oxide，CO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)之后發現的新型氣體信號分子。哺乳動物體內以L-半胱氨酸為底物，通過激活5’-磷酸吡哆醛依賴性酶：胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)和胱硫醚 β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)生成H2S[4]。CBS和CSE在哺乳動物組織和細胞中分布廣泛[5]。CBS主要存在于神經系統，而CSE主要分布于外周系統，尤其是肝、腎及血管系統[6]。最近，有研究發現H2S對糖尿病大鼠腎臟病變具有保護作用，其機制可能與抑制腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)系統的激活有關[7]。然而，硫化氫對高糖導致的足突細胞損傷是否具有保護作用？目前尚未見報道。本文擬觀察硫化氫在高糖誘導的腎小球足突細胞損傷中的作用，并探討其機制。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠足細胞系MPC5由山東大學醫學院易凡教授惠贈。無糖RPMI-1640培養基和新生胎牛血清，D-葡萄糖，CSE特異性抑制劑DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PPG)及NaHS；兔抗ZO-2、兔抗CSE、小鼠抗β-catenin、抗nephrin、抗β-actin及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔和羊抗鼠II抗，ECL發光液，BCA試劑盒，膠片。

2 主要方法

2.1細胞培養 將MPC5細胞接種于含5.5 mmol/L葡萄糖、1×104U/L γ-干擾素、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640完全培養基中，33 ℃、5% CO2培養，在γ-干擾素的作用下傳代增生。繼而置于不含γ-干擾素的RPMI-1640完全培養基中，37 ℃、5% CO2培養10～14 d使其分化成熟，2～3 d換液，待細胞融合至80%左右，無血清培養24 h，使細胞同步化。同步化細胞分組：高糖組(30 mmol/L葡萄糖)；正常糖組：5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇;正常糖(5.5 mmol/L葡萄糖)+24.4 mmol/L甘露醇+PPG(0.1 mmol/L)；正常糖(5.5 mmol/L葡萄糖)+23.5 mmol/L甘露醇+PPG(1 mmol/L)；正常糖(5.5 mmol/L葡萄糖)+14.5 mmol/L甘露醇+PPG(10 mmol/L)；高糖(30 mmol/L葡萄糖)+ NaHS(100 μmol/L)組。于各處理時點，收集細胞并進行Western blotting分析。

2.2Western blotting 細胞經處理后，用PBS沖洗2遍，冰上裂解，裂解液：20 mmol/L Tris-HCl， 0.1 mmol/L Na3VO4，25 mmol/L NaF，25 mmol/L β-磷酸甘油，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，2 mg/L 抑肽酶(aprotinin)，2 mg/L亮抑蛋白酶肽(leupeptin)，pH 7.5。4 ℃條件下離心15 min(14 000 r/min)，取上清并用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白(20 μg)上樣，經10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃條件下，I抗孵育12 h，TBST充分洗膜后，1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記II抗室溫雜交1 h。TBST洗膜，ECL顯色，結果定量分析用NIH ImageJ 1.42軟件處理。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 高糖對足突細胞nephrin、ZO-2和β-catenin表達的影響

高糖(30 mmol/L)處理12 h，足突細胞nephrin及ZO-2蛋白水平顯著降低，48 h降至最低；β-catenin蛋白水平12 h顯著升高(P<0.05)，48 h達到高峰(P<0.01),見圖1。

Figure 1. Effects of high glucose (HG,30 mmol/L) on nephrin，ZO-2 and β-catenin protein expression at different time points. Mean±SD. n=3. △P<0.05，△△P<0.01 vs HG 0 h group.

2 高糖對CSE蛋白表達的影響

與NG組相比，HG組CSE的表達量明顯下降(P<0.05)，48 h降至最低(P<0.01),見圖2。

Figure 2. The effect of high glucose (HG,30 mmol/L) on expression of CSE at 0 h，12 h，24 h and 48 h. Mean±SD. n=3. △P<0.05,△△P<0.01 vs HG 0 h group.

3 PPG對小鼠足突細胞nephrin、ZO-2及β-catenin的影響

對正常糖濃度培養的足突細胞，分別給予不同濃度的PPG處理48 h,PPG可顯著抑制nephrin和ZO-2的表達(P<0.05)，并具有濃度依賴性；而同時顯著增加β-catenin的蛋白表達水平(P<0.05),見圖3。

Figure 3. Effects of different concentrations of PPG on the expression of nephrin，ZO-2 and β-catenin at 48 h. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs NG group.

4 NaHS對高糖培養的足突細胞nephrin、ZO-2及β-catenin表達的影響

與NG組相比，HG處理48 h nephrin和ZO-2的表達量明顯減少(P<0.01)，β-catenin的表達量明顯增加(P<0.01)；HG+NaHS組nephrin和ZO-2蛋白水平較HG組顯著增加(P<0.01)，但仍低于NG組(P<0.01)；β-catenin較HG明顯減少(P<0.01)，但仍高于NG組(P<0.01),見圖4。

討 論

蛋白尿是糖尿病腎病重要的臨床表現，是臨床診斷的重要指標，從早期的微量白蛋白尿到中晚期的大量蛋白尿均可使腎功能進行性惡化。糖代謝異常是糖尿病腎病足突細胞病變的始動因素，高血糖可以使腎小球濾過膜的通透性增加[8]，足突細胞是腎小球濾過膜的最后一道屏障，兼有大小選擇性和電荷選擇性，其病變可導致大分子血漿蛋白從腎小球漏出，大量蛋白的漏出又會加重足突細胞損傷和腎小球硬化。足突細胞的脫落和凋亡明顯落后于蛋白尿的產生，這提示受高糖刺激后，足突細胞分子水平損傷的觸發最后導致蛋白尿的產生。Nephrin由NPHS1編碼，是足突細胞裂孔膜的標記蛋白之一，與白蛋白從濾過膜的濾出密切相關，其下調還可進一步導致腎小球硬化和腎功能惡化[9]，是足突細胞損傷的重要標志性蛋白，已有研究表明其下調可能與Wnt/β-catenin通路的異常激活有關[10]。

Figure 4. The effect of hydrogen sulfide on protein levels of nephrin， ZO-2 and β-catenin at 48 h. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs NG group；##P<0.01 vs HG group.

Wnt信號通路在足突細胞損傷和蛋白尿形成中起關鍵作用，在Wnt缺乏時，轉錄激活因子和黏著連接的連接蛋白β-catenin與軸蛋白、大腸腺瘤樣息肉蛋白和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)結合成復合體存在于胞質中，GSK3β可以磷酸化β-catenin并使其降解，細胞內β-catenin含量較低；當該通路被激活時，作為胞外配體的Wnt與細胞表面的Frizzled受體和共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白結合，GSK3β被磷酸化失活，β-catenin無法被泛素化而不能降解，胞漿中富集的β-catenin移位至核內，與轉錄因子LEF/TCF一起激活靶基因的轉錄。在足突細胞中，如Wnt1等多種Wnt家族蛋白表達的增多，抑制了β-catenin的磷酸化，胞內富集的β-catenin可活化表達關鍵的轉錄因子snail，進而抑制nephrin的表達導致足突細胞功能障礙[11-12]，最新研究顯示，ZO-2可能參與調控Wnt通路[3,13]。

ZO-2是廣泛表達在上皮細胞緊密連接處及核內的骨架蛋白，帶有多個膜相關鳥苷酸激酶特征性的蛋白結合位點，包括3個PDZ結構域，1個SH3結構域，1個GuK結構域[3]，作用廣泛，比如，可以將緊密連接閉合蛋白和封閉蛋白結合在肌動蛋白骨架上，能與黏著連接的α-連環蛋白、縫隙連接蛋白36和43以及其它緊密連接蛋白如ZO-1、扣帶蛋白結合。在腎臟，ZO-2存在于腎小球足突細胞和腎小管上皮細胞中，與ZO-1不同的是，在腎小球ZO-2與巢蛋白(nestin)共定位于足突細胞的足突上，目前已知其與體內多種細胞增殖、凋亡、腫瘤和氧化應激相關[13-14]。有研究指出，ZO-2可抑制GSK3β被磷酸化，促進β-catenin在胞質中的累積，防止nephrin的丟失，避免足突細胞大規模融合或丟失[3,13]。這可能是足突細胞功能障礙導致蛋白尿形成的重要機制之一。

腎臟的內源性H2S通過半胱氨酸由CBS、CSE和3-巰基丙酮酸轉硫酶催化作用產生[15]，具有強大的抗氧化、抗凋亡和抗炎作用，Yuan[16]等研究發現，硫化氫可以改善高糖條件下產生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)對腎小球系膜細胞的損傷，高糖環境影響降低NAPDH氧化酶這類促進ROS產生的酶類活性，打破了氧化還原反應的平衡，使硫化氫生成減少，足突細胞是否含有合成內源性H2S的酶類及其對足細胞的作用機制目前仍不清楚。

本研究發現高糖培養的足突細胞表達nephrin明顯減少，提示高糖可導致足突細胞的損傷，我們繼而觀察了ZO-2和β-catenin的變化，結果表明高糖刺激顯著降低了ZO-2的表達，激活了Wnt/β-catenin通路，這與既往研究結果一致。CSE是體內產生硫化氫所必需的酶類，業已證實其在腎臟中高表達，細胞水平上已證實系膜細胞中存在CSE，而足突細胞中是否存在還未證實。我們研究證實在足突細胞中有CSE表達，此外，本實驗結果顯示高糖在抑制nephrin表達的同時，也降低了CSE的表達水平。為了明確高糖誘導的CSE降調節是否與足突細胞損傷有關， 我們進一步觀察了CSE特異性抑制劑PPG對nephrin表達的影響。結果發現CSE特異性抑制劑顯著降低了正常糖條件下的小鼠足突細胞的nephrin表達，且具有劑量依賴性，從而提示高糖誘導的CSE降調節可能是造成足突細胞損傷的機制之一。此外，我們以100 μmol/L NaHS[17-18]作為硫化氫的供體處理細胞，結果顯示NaHS對高糖誘導的Nephrin降調節具有顯著抑制作用，提示外源性硫化氫對高糖環境下的小鼠足突細胞損傷具有一定的防治作用。

為了探討硫化氫的作用機制，我們觀察了CSE特異性抑制劑對ZO-2及Wnt/β-catenin通路的影響，結果提示CSE特異性抑制劑可顯著抑制ZO-2表達，而增加β-catenin的蛋白水平。與之相反，外源性硫化氫則顯著抑制了高糖誘導的ZO-2降調節及β-catenin蛋白水平的升高。以上結果提示，硫化氫對高糖誘導足突細胞損傷的保護作用可能是通過對ZO-2蛋白的表達調控而實現的，但詳細機制尚有待進一步探討。總之，本研究結果提示高糖誘導的足突細胞CSE表達降低可能是足突細胞損傷的重要機制之一。而外源性硫化氫對高糖誘導的足突細胞損傷具有一定保護作用，其機制可能與增加ZO-2蛋白表達、抑制Wnt/β-catenin通路有關。本研究為糖尿病腎病的防治提供了新的思路，而本研究結果有待體內實驗進一步證實。

[參 考 文 獻]

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