卡托普利對AGS胃癌裸鼠移植瘤模型的調控作用*

李 力， 金震東， 蔡 敏， 王 斌， 程烽濤

(1第二軍醫大學附屬長海醫院消化內科，上海 200433； 2上海楊浦區中心醫院消化內科，上海 200090)

胃癌是常見高發惡性腫瘤之一，且死亡率居高不下[1-2]。胃癌的化療藥物研發周期長、耗資大風險高，致使目前新藥的研發進展較為緩慢，所以既能夠避免新藥研發耗時又能夠保障安全性的“老藥新用”就成為了現在臨床藥品研發的一大關注熱點。血管緊張素轉換酶抑制劑卡托普利(captopril)已臨床應用多年，具有較好的安全性，長期應用對多種腫瘤的發生有抑制作用[3-4]。但是，到目前為止，關于卡托普利對胃癌的治療作用尚無報道，因此探索卡托普利在胃癌患者中的可行性具有重要的臨床價值。本研究將首次從體內實驗角度觀察卡托普利對胃癌的治療作用，并初步探討其臨床治療的可行性及機制。

材 料 和 方 法

1 主要實驗材料

裸鼠(由上海斯萊克動物中心提供)，人胃癌細胞株AGS(中國科學院上海生科院細胞資源中心)，卡托普利(Sigma)，實驗所需各檢測指標抗體均購于Abcam，Trizol(Invitrogen),real-time檢測儀(ABI-7300)，熒光顯微鏡(CX41，Olympus)，IMS圖像分析系統(基爾頓生物科技上海有限公司)。

引物序列：Ki-67 上游引物5’-TGGCCTACCTGGTCTTAGTTC-3’，下游引物5’-TCCTCTTGGTTGGCGTTTC-3’；信號轉導子和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)上游引物5’-GACTCAAAGCCACCTCATTC-3’，下游引物5’-GCCTTGCCTTCCTAAATACC-3’;Bax上游引物5’-TAGCAAACTGGTGCTCAAGG-3’,下游引物5’-AGCCACAAAGATGGTCACTG-3’；Bcl-2上游引物5’-CATGCACCAAGTCCAGTACAG-3’,下游引物5’-TACAGGCATTGCCGCATAG-3’；GAPDH上游引物5’-ATCACTGCCACCCAGAAG-3’,下游引物5’-TCCACGACGGACACATTG-3’。

2 方法

2.1模型制作及分組

2.1.1動物 BALB/c裸鼠，5～6周齡，雄性，SPF級。

2.1.2AGS腫瘤細胞皮下注射法動物模型制作 將足夠體外培養腫瘤細胞在對數生長期用0.25%胰酶消化后洗出，最后加入PBS或0.9%NaCl注射液制成1×1010/L，鏡下計數，并觀察活細胞數在95%以上。一次性注射器抽取混勻的細胞懸液0.2 mL，左手固定小鼠偏右側，皮膚消毒后，從小鼠側面肋骨緣處進針至腋窩皮下，推入細胞懸液，緩緩拔出針頭，用針橫推皮下液體，使其固定在腋窩部位，可使腫瘤生長較圓整。給予純凈水，標準飼料，屏障系統內IVC隔離籠具飼養。

2.1.3分組 將裸鼠隨機分為3組，每組各15只，分組情況如下：陽性對照(5-氟尿嘧啶，5-fluorouracil,5-Fu)組、對照(生理鹽水)組和卡托普利干預組。

2.2處理 陽性對照組給予5-Fu腹腔注射，劑量為(0.6 mg/只),卡托普利干預組給予卡托普利灌胃，劑量為(2.8 mg/只)，實驗開始后每天觀察裸鼠的生存質量并注意是否出現死鼠[5]。干預31 d后，無死鼠，取腫瘤組織進行后續實驗。

2.3檢測方法 將所取組織經脫水-石蠟包埋-切片后進行下列實驗：(1)采用實時熒光定量PCR、Western blotting以及免疫組化檢測Ki-67、STAT3、Bax、Bcl-2和磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)表達；(2)TUNEL+DAPI染色法：對組織切片顯微鏡下觀察并拍照，檢測細胞凋亡。

3 統計學處理

用SPSS 17.0軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 腫瘤生長情況

造模成功后，各組小鼠均出現差異不明顯的腫瘤結塊。隨時間推移，對照組裸鼠腫瘤塊較其它2組明顯生長加快，卡托普利組居中，5-Fu組最慢。到第14天各組差異開始明顯加大(P<0.05)，變化趨勢如圖1所示。

Figure 1. Growth of the tumor.Mean±SD.n=15.*P<0.05 vs conrtol； #P<0.05 vs 5-Fu.

2 Tunel+DAPI染色結果

TUNEL+DAPI結果顯示，5-Fu組以及卡托普利組的組織癌細胞凋亡率[(21.45±0.11)%和(37.57±0.13)%]較對照組[(11.10±0.05)%]有明顯上升(P<0.05)。卡托普利組凋亡率最高，與5-Fu組比較差異顯著(P<0.05)，見圖2。

3 實時熒光定量PCR檢測結果

由Real-time結果(圖3)可以看出，各組藥物干預31 d后，各相關因子mRNA表達量均有不同程度變化，其中，卡托普利組Bax相較于對照組有明顯上升，而STAT3、Ki-67以及Bcl-2的表達則呈下調趨勢(P<0.05)。5-Fu組與卡托普利組各相關因子表達趨勢相一致，但2組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

4 免疫組化結果

相較于對照組，卡托普利組Bax表達明顯上升，而Ki-67、STAT3以及Bcl-2的表達下降(P<0.05)。卡托普利組各因子表達趨勢與5-Fu組表達趨勢一致，但2組間差異顯著(P<0.05)。免疫組化結果與PCR檢測結果吻合，見圖4、表1。

5 Western blotting檢測結果

5-Fu組和卡托普利組p-STAT3和STAT3蛋白表達均較對照組明顯降低(P<0.05)，見圖5。

討 論

研究發現，腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)在癌癥發生的各個階段都起著極為重要的作用，但機制未被明確闡述。目前RAS系統抑制劑——血管緊張素II(angiotensinⅡ，AngⅡ)抑制劑作為抗癌藥的研究受到眾多關注，但其對胃癌的應用研究尚少。血管緊張素轉化酶抑制劑一直以來主要作為降壓藥品被廣泛應用。近年來，該類藥物的抗腫瘤作用日益受到眾多學者們的關注并進行了相關的研究。本實驗研究以AGS裸鼠胃癌模型為研究對象，通過觀察檢測使用血管緊張素轉化酶抑制劑卡托普利治療后裸鼠腫瘤相關因子的變化，來判斷并推測卡托普利在胃癌治療應用方面的可行性并初步探索其作用機制。本研究發現，藥品干預31 d后，腫瘤細胞凋亡率較對照組有明顯升高(P<0.05)，可見卡托普利在胃癌治療方面具有一定可行性。通過腫瘤相關因子Ki-67、STAT3、p-STAT3、Bax和Bcl-2的檢測發現，這些因子在卡托普利干預的同時有著相應的趨勢變化，推測可能在干預過程中，卡托普利直接或間接調控或者影響腫瘤相關因子，從而達到抑制腫瘤細胞生長或誘導其凋亡的目的。到目前為止，研究發現卡托普利不僅具有抑制細胞凋亡的作用[6-7]，還能夠誘導細胞的凋亡[8]，曾有人推測這2種截然不同的結果可能是由細胞類型、卡托普利用藥量以及病理狀態所決定的[9]，還有研究表明，Ang Ⅱ能夠調節生長因子促血管發生，它可能是通過血管緊張素II 1型受體(angiotensin II type 1 receptor, AT1R) 下調血管生成作用[10-12]。亦有研究表明，ACEI類藥品可能通過AngⅡ-AT1R途徑減少血管的發生及腫瘤的生長轉移[13]。STAT3作為信號轉導及轉錄活化家族的重要成員，廣泛表達于各種類型的細胞以及組織當中，它的持續激活可導致細胞異常增殖與惡性轉化，被認為是癌基因的一種[14]。研究證明，它并不直接介導腫瘤的發生，而是通過對其下游靶基因(如Bcl-2、Bax等)的調控來影響腫瘤的進程，且STAT3蛋白表達與血管內皮生長因子蛋白之間也具有顯著相關性[15]。STAT3以及它的活化形態p-STAT3在腫瘤細胞的侵襲和轉移中也起著一定作用[16]。STAT3與 p-STAT3在腫瘤中的表達一定程度上也表明了腫瘤細胞的侵襲轉移程度[17]。本研究發現，經過卡托普利干預后，腫瘤組織中的STAT3以及p-STAT3表達均有降低且腫瘤細胞凋亡增加，說明卡托普利可能是通過對STAT3的調節來實現對腫瘤細胞凋亡的誘導或抑制其增殖。本實驗研究表明，卡托普利對胃癌的治療有較為明顯的治療效果，在對胃癌的臨床治療上可能具有一定可行性，但其臨床可應用性需要進行進一步的研究。

Figure 4. Immunohistochemical results of the related factors (×200).

表1 相關因子陽性表達面積的比較

Figure 5. Expression of p-STAT3 and STAT3 proteins in diffe-rent groups.Mean±SD.n=15.*P<0.05 vs conrtol；#P<0.05 vs 5-Fu.

[參 考 文 獻]

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