劍麻總皂苷高產菌的篩選及發酵條件的優化

周菲菲+郝再彬+易克賢+鄭金龍+王秀麗+

摘要：以綠色環保發酵生產提取劍麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）總皂苷為目標，采集土壤樣品，對菌株進行初篩和復篩得到１株菌株，編號ＪＭＺ－Ｎ０６。通過料液比、發酵溫度、發酵時間、發酵液初始ｐＨ四因素三水平的正交試驗，確定了該菌的最適發酵條件為料液比１∶２０（g∶mL），發酵時間６０ ｈ，發酵溫度３２ ℃，發酵液初始ｐＨ ６．０。

關鍵詞： 劍麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）；正交試驗；發酵條件；優化

中圖分類號：Ｑ８１５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）08－1863-05

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ Extracting Agave sisalana perr.ex Engelm Ｔｏｔａｌ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ

ＺＨＯＵ Ｆｅｉ－ｆｅｉ１， ＨＡＯ Ｚａｉ－ｂｉｎ１， ＹＩ Ｋｅ－ｘｉａｎ２， ＺＨＥＮＧ Ｊｉｎ－ｌｏｎｇ２， ＷＡＮＧ Ｘｉｕ－ｌｉ１

（１．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Bｉｏｌｏｇｉｃａｌ Eｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Cｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｌｉｎ Uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Tｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ

２．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： To ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌly ectract ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Agave sisalana perr.ex Engelm ， ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｎｏ． ＪＭＺ－Ｎ０６ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｗｉｃｅ ｓｃｒｅｅｎ ｆｒｏｍ ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍal ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌｓ and ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ including ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Agave sisalana perr.ex Engelm ｗａｓ １４２．５ ｍｇ／ｇ ｗｈｅｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ６０ ｈ ｕｎｄｅｒ ３２ ℃ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ １∶２０（g∶mL） ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ６．０.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Agave sisalana perr.ex Engelm； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

劍麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）又名鳳尾蘭，是生產硬質纖維的主要經濟作物，由于劍麻葉片中纖維的含量僅占其本身的３％～５％，因此在劍麻纖維的加工過程中將產生大量的廢棄物，如抽取纖維后產生的麻渣、麻汁，劍麻纖維加工過程中產生的麻糠、麻頭等。這些廢棄物中含有豐富的皂苷、果膠、葉綠素和纖維素，若將其直接排放或堆放，不僅導致大量資源的浪費，而且會對環境造成嚴重污染［１］。劍麻皂苷具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、止血、抗衰老、降血糖和保肝等多種活性［２－５］，被廣泛應用于食品、保健品、藥品等諸多領域。劍麻皂苷主要包括兩部分即糖和苷元，分子結構如圖１（Ｒ為糖），有５種單體結構Ｄｏｎｇｓａｐｏｎｉｎ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ［６－８］，平均相對分子質量為１ ２０９．８。

傳統的皂苷分離提取方法主要有溶劑法、酸堿沉淀法、超聲萃取法、超臨界萃取法和生物工程發酵法。溶劑法局限性是提取分離有效組分的量以及純化的程度都較低。酸堿沉淀法局限性是單相酸水解條件劇烈，常伴有脫水、構型變化等。超聲萃取法能夠避免高溫高壓對有效成分的破壞，但其對容器壁厚薄和容器的擺放位置有很高的要求。超臨界萃取法對物料有較好的滲透性和較強的溶解能力，對 物料某些成分的提取具有更高的效率，但是皂苷類化合物的分子量大、羥基多、極性大，需要加大壓力和加入適當的試劑來提高萃取產率。生物工程發酵法是通過加入菌株加速植物細胞壁的破除釋放出有效成分［９］，從而降低提取難度，可減少原料、化工試劑，節約動力和勞力，減少環境污染［１０］。

１材料與方法

１．１材料與試劑

１．１．１菌種來源從廣西桂林市周邊山地采集到幾百份土壤樣品，從中篩選。

１．１．２主要試劑劍麻皂苷元標準品（９８％，ＨＰＬＣ純，上海研生生物技術有限公司），劍麻殘渣（廣西劍麻集團），ＤＮＳ試劑：２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ（２６２ ｍＬ）與３，５－二硝基水楊酸（６．３０ ｇ）混合加入５００ ｍＬ的熱水溶液中（含１８２ ｇ的酒石酸鉀鈉），再加入苯酚５．００ ｇ及亞硫酸鈉５．００ ｇ，待溶解完全，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至１ Ｌ，貯存于棕色試劑瓶中，室溫放置１０～１５ ｄ即可使用。

１．１．３培養基ＰＤＡ培養基：馬鈴薯２００．００ ｇ，葡萄糖２０．００ ｇ，瓊脂粉１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；木聚糖培養基：馬鈴薯２００．００ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，瓊脂粉１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；篩選平板培養基：ＮａＮＯ３ ３．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，瓊脂１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；搖瓶發酵培養基：ＮａＮＯ３ ３．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ， ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，加水至１ Ｌ；種子培養基：ＮａＮＯ３ ２．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，葡萄糖３．００ ｇ，木聚糖２．００ ｇ，加水至１ Ｌ；產酶基礎培養基：葡萄糖５．００ ｇ，蛋白胨６．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＣｌ ０．０５ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，加水至１ Ｌ。

１．１．４儀器Ｃａｒｙ５０型紫外可見光分光光度計（美國ＶＡＲＩＡＮ公司），ＳＨＺ－Ｄ（Ⅲ）型循環水式多用真空泵（鞏義市子華儀器有限公司），手提式高壓滅菌器（上海華線醫用核子儀器有限公司），ＤＺＦ－６０５０型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），ＬＲＨ－１５０－Ｚ（Ⅱ）型微電腦控制振蕩培養箱（廣東省醫療器械廠）。

１．２試驗方法

１．２．１菌種初篩無菌水浸泡劍麻麻渣２４ ｈ，紗布過濾，濾液備用。取土壤樣品１０ ｇ，放入盛有１００ ｍＬ麻渣濾液三角瓶中。３０ ℃ １６０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養２４ ｈ，取該土壤稀釋液５ ｍＬ離心，上清液涂布于篩選平板上，３０ ℃下恒溫培養，挑選單菌落進一步復篩。

１．２．２菌種復篩將初篩的菌株在ＰＤＡ液體培養基中純化，加入到種子培養基中，３０ ℃下培養３２ ｈ備用。

分別精密量取０．００、０．２０、０．４０、０．６０、０．８０、１．００、１．２０、１．４０、１．６０ ｍＬ葡萄糖標準溶液（母液濃度１ ｍｇ／ｍＬ），加入２５ ｍＬ具塞比色管中，編號 ０～８。加去離子水補足至２．００ ｍＬ，加入１．５０ ｍＬ ＤＮＳ 試劑，沸水中顯色５ ｍｉｎ，冷卻至室溫后，加去離子水定容至２５ ｍＬ，充分混勻，在波長５４０ｎｍ處檢測ＯＤ５４０ nm。以還原糖的含量ｘ（ｍｇ）對光密度Ｙ進行回歸，得標準曲線方程為Ｙ＝０．１２８ｘ－０．０２０，ｒ＝０．９９９ 0，濃度范圍１０～７０ μｇ／ｍＬ。

１．２．３ＤＮＳ 法測定菌體發酵還原糖的能力取備用菌液３０ ｍＬ離心４ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ，收集菌體，加入到２％木聚糖的ＰＤＡ培養基中，恒溫搖床培養４８ ｈ，離心４ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ，取上清液，制備成還原糖提取液，ＤＮＳ法檢測提取液中還原糖的含量。

１．２．４菌株生長曲線的繪制以１０％的接種量，將培養３ ｄ種子菌液接種到產酶發酵培養基中，２５ ℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ搖瓶培養，間隔２ ｈ檢測發酵液的ＯＤ５６０ nm，繪制發酵液中生物量、菌體與光密度的曲線。

１．２．５劍麻皂苷元標準曲線的制作制備皂苷元標準曲線：稱量劍麻皂苷元標準品５．００ ｍｇ，用甲醇溶解并定容至５ ｍＬ，分別吸取０．２、０．４、０．６、０．８和１．０ ｍＬ置２５ ｍＬ具塞試管中，以空白管作對照，在７０ ℃下烘干后冷卻至室溫。各管中依次加入５％香草醛冰醋酸０．２ ｍＬ，高氯酸０．８ ｍＬ，搖勻后置于７０ ℃烘箱中加熱１５ ｍｉｎ，取出后迅速流水冷卻至室溫，再分別加入５ ｍＬ冰醋酸，搖勻，于４５０ ｎｍ處測定光密度值ＯＤ４５０ ｎｍ。以含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

１．３高產菌株發酵劍麻皂苷條件優化

選取料液比、發酵時間、發酵溫度、發酵液酸堿度４個因素，通過麻渣中皂苷的提取率確定其適宜的發酵條件［１１－１４］。

１．３．１料液比對提取率的影響活化的種子菌液３０ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，取沉淀備用。加入１００ ｍＬ無菌水稀釋，制備８支稀釋菌液，每４支一組。第一組滅活菌體１～４支作對照，兩組試管分別加入５、１０、１５、２０ ｇ麻渣，標記號１～４和５～８。２８ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養４８ ｈ，取發酵液５ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，取上清液，吸取１００ μＬ，對應標記１～８，真空干燥箱中烘干。其余同皂苷檢測。

１．３．２發酵時間對提取率的影響種子菌液３０ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，取沉淀備用。稱取５ ｇ麻渣于１００ ｍＬ無菌水中，菌體加入麻渣料液中，１６０ ｒ／ｍｉｎ 恒溫培養箱中培養，在１２、２４、３６、４８、６０、７２ ｈ時取發酵液離心，上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷檢測。

１．３．３發酵溫度對提取率的影響稱取５ ｇ麻渣于１００ ｍＬ無菌水中，分別置于２４、２６、２８、３０、３２和３４ ℃下１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養４８ ｈ，將發酵液離心，取上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷檢測。

１．３．４發酵液初始ｐＨ對總皂苷提取率的影響稱取５ ｇ麻渣于１００ ｍＬ無菌水中。３０ ｍＬ種子菌液４ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，沉淀菌體加入麻渣料液中，調整發酵液ｐＨ依次為 ３、４、５、６、７和８，１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養４８ ｈ，將發酵液離心，取上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷檢測。

１．３．５正交試驗設計根據以上單因素的試驗結果，選取料液比（Ａ）、發酵時間（Ｂ）、發酵溫度（Ｃ）、發酵液初始ｐＨ（Ｄ）為試驗因素，按照正交試驗設計Ｌ９（３４）進行試驗，以劍麻總皂苷的提取量為考察指標，進行提取工藝的優選［１５］。因素與水平見表１。

１．３．６劍麻總皂苷提取工藝的穩定性按照正交試驗選擇的最優條件，重復皂苷的提取試驗，評價試驗結果［１６］。

２結果與分析

２．１ＪＭＺ－Ｎ０６菌株的篩選獲得

由圖２可知，該菌株平板培養時菌落表面光滑；光學顯微鏡下呈短棒形態；透射電鏡下無鞭毛，長寬比２∶１。

２．２復篩

由表２可知，該菌株對木聚糖有較高的降解能力。因此該菌加速劍麻麻渣中木聚糖向單糖的降解，從而有利于麻渣中皂苷的釋放，達到提高得率的目的。菌株有進一步研究的價值。

２．３菌株繁殖生長

細胞生長曲線是判定細胞活力的重要指標，也是細菌生物學特性的基本參數之一。一定波長下菌液的光密度表示菌量。由圖３可知，培養３２ ｈ時，種子菌體吸光值達到對數生長期，此時發酵液中菌體活性最高，代謝活動最旺盛。

２．４劍麻皂苷元的標準曲線

測得劍麻皂苷元標準曲線方程為ｙ＝１．４１６ｘ＋０．０４２ ７，R2＝０．９９８ 0，在０．１～０．７ ｍｇ范圍內具有良好的線性關系（圖4）。根據劍麻皂苷的5種單體結構計算得出劍麻總皂苷的相對分子質量為１ ２０９．８，即得劍麻總皂苷的量Ｍ（ｍｇ）與光密度對應方程為Ｍ＝（ｙ－０．０４２ ７）×２．９０／１．４１６ ０。

２．５料液比對劍麻總皂苷提取率的影響

由表３可知，菌液接種量一定的情況下，１００ ｍＬ發酵液中加入的麻渣質量在１～５ ｇ時，皂苷的提取量隨著麻渣質量的增加而明顯增大，當麻渣加入量超過５ ｇ時，其麻渣中總皂苷的提取率隨著麻渣質量的增加而逐漸減小。

２．６發酵時間對劍麻總皂苷提取率的影響

由表４可知，發酵１２～４８ ｈ時，皂苷的提取率隨著發酵時間的延長而增大，之后略減小，可見在發酵４８ ｈ時總皂苷提取率最大。

２．７發酵溫度對劍麻總皂苷提取率的影響

由表５可知，２４～３０ ℃時，隨著溫度的上升總皂苷提取率明顯增加，之后提取率反而下降，溫度越高劍麻總皂苷提取量越低。

２．８發酵液初始ｐＨ對劍麻總皂苷提取率的影響

由表６可知，初始ｐＨ為５．０時總皂苷的提取量達到最大值，當ｐＨ超過５．０時總皂苷提取率又迅速減少。

２．９正交試驗結果

由表７中極差的直觀分析法 Ｒ值可以看出，因素Ｂ的極差最大，說明發酵時間對總皂苷提取率的影響最大，其次是因素Ｄ和Ｃ，料液比對總皂苷提取率的影響最小。所以這４個因素對皂苷提取的影響由大到小的順序依次為Ｂ、Ｄ、Ｃ、Ａ。由表７可知，劍麻總皂苷提取發酵最佳工藝條件為Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ２，即料液比１∶２０（１ Ｌ發酵液中加入麻渣５０ ｇ），發酵時間６０ ｈ，發酵溫度３２ ℃，發酵液初始ｐＨ ６．０。

４結論

本試驗篩選１株ＪＭＺ－Ｎ０６，用于劍麻總皂苷的提取。以總皂苷提取量為指標，對發酵提取工藝進行了優選，最佳工藝條件為料液比１∶２０（g:mL），發酵時間４８ ｈ，發酵溫度３２ ℃，發酵液初始ｐＨ ６．０。通過生物工程發酵法降解麻渣，降低了提取難度，使含有豐富皂苷資源的廢棄物變廢為寶可以實現規模生產。

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