鐘 越， 齊 玲， 沈 楠， 王瑋瑤， 田 晶， 王艷春

(吉林醫(yī)藥學院，吉林 吉林 132013)

篤斯越桔(VacciniumuliginosumLinn.)是我國野生越桔的主要品種，在吉林省長白山地區(qū)分布最廣。篤斯越桔以富含原花青素(procyanidin，PC)著稱。研究發(fā)現(xiàn)原花青素具有抗壓力、抗氧化、抗炎癥、抗動脈硬化、抗衰老、抗腫瘤及增強免疫功能等多種生物學作用，且不良反應(yīng)低[1-3]。越桔原花青素抗腫瘤作用的研究較少，在腦膠質(zhì)瘤中的作用尚未見報道。本實驗從多方面來研究越桔原花青素對腦膠質(zhì)瘤C6細胞生長的作用，并探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞株 大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細胞株由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院提供。

1.2主要試劑 越桔原花青素(南京蘇朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司)；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基 (HyClone)；小牛血清和0.25%胰酶(Gibco)； MTT和DMSO(Sigma)；Bcl-2、Bax、caspase-3和β-actin抗體(北京中杉公司)。

1.3儀器 J-26XP超低溫高速離心機(貝克曼公司)；超低溫冰箱(MDF-U53V)；PLUS 384全自動酶標儀(MDC)；IX-70型倒置式顯微鏡(Olympus)；DNA蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；Image-Pro Plus 圖像分析管理系統(tǒng) (Media Cybernetics)。

2 方法

2.1C6細胞的培養(yǎng) 將C6腦膠質(zhì)瘤細胞接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，隔日換液1次。

2.2越桔原花青素對C6細胞生長的影響 取對數(shù)生長期的C6細胞制成單細胞懸液，按6 000 cells/well密度將細胞接種于96孔板，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入不同濃度越桔原花青素(0、10、20和40 μg/L)，每個藥物濃度設(shè)5個復(fù)孔，分別作用24、48和72 h后棄上清，再加入MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h，棄上清后每孔加DMSO 150 μL并振蕩。同時設(shè)空白對照組，測定各孔570 nm處的吸光度(A570) 值，細胞存活率(%)=A實驗/A對照×100%。

2.3觀察C6細胞凋亡形態(tài) 按5 000 cells/well密度將C6細胞接種于24 孔板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁，加入不同濃度的越桔原花青素(0、10、20和40 μg/L)，設(shè)空白對照組。培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.4凋亡率檢測 取對數(shù)生長期的C6細胞，按細胞濃度2×108/L接種于6 孔板，每孔2 mL。3個實驗組均加入越桔原花青素，使其終濃度分別為10、20和40 μg/L，空白對照組加入等體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h 離心收集細胞。PBS 洗滌2 次，按照說明書操作，用1∶4 binding buffer 緩沖液190 μL 重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為(2～5)×108/L，然后加入FITC標記的Annexin V-FITC 5 μL和20 mg/L PI 10 μL，置冰上10 min，流式細胞術(shù)檢測各樣品中每10 000 個細胞中細胞的凋亡率。

2.5免疫細胞化學法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達 將C6細胞按1×104cells/well密度接種于置有玻片的24孔板中，實驗設(shè)未加藥物的對照組和越桔原花青素(10、20和40 μg/L)組，分別作用72 h后，10%甲醛溶液固定，滅活封閉，Bcl-2和Bax抗體孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，顯色、脫水、透明后封片，選擇5個不同視野，采用Image-Pro Plus分析軟件分析蛋白陽性產(chǎn)物的積分吸光度值，取平均值進行統(tǒng)計分析。

2.6Western blotting法檢測Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達 取對數(shù)生長期的C6細胞，按細胞濃度1×108/L接種于6孔板中，每孔5 mL。實驗組加入越桔原花青素，使其終濃度為10、20和40 μg/L，作用72 h，每組設(shè)3個復(fù)孔，空白對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將細胞收至1.5 mL離心管中，離心后棄上清，PBS洗滌細胞，50 μL細胞裂解液充分裂解細胞。12 000×g、4 ℃ 離心15 min，留上清，測定樣品蛋白濃度，SDS-PAGE跑膠分離樣品，轉(zhuǎn)膜封閉，加入β-actin、Bcl-2、Bax和caspase-3 抗體，4 ℃孵育過夜。Ⅱ抗室溫孵育1 h，膠片曝光拍照。結(jié)果采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)分析，以特異性條帶平均吸光度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達的水平。

3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 越桔原花青素對C6膠質(zhì)瘤細胞生長的抑制作用

MTT結(jié)果顯示，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6膠質(zhì)瘤細胞24、48和72 h，均可以明顯地抑制細胞的生長。當越桔原花青素作用于C6細胞24和48 h，40 μg/L濃度組膠質(zhì)瘤細胞的生長明顯地受到抑制，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；越桔原花青素作用于C6細胞72 h，20和40 μg/L濃度組膠質(zhì)瘤細胞的生長亦明顯受抑制，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01) ,并且藥物作用具有濃度依賴性，見圖1。

Figure 1. Effects of Vaccinium vitis procyanidin on the survival rate of C6 glioma cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group.

2 越桔原花青素抑制C6細胞生長的形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下觀察，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細胞72 h，與空白對照組比較，各濃度組培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁細胞明顯減少，并且隨著藥物濃度的增高，細胞密度呈下降趨勢,見圖2。

3 越桔原花青素對C6細胞的誘導凋亡作用

10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細胞72 h后，Annexin V/PI分析各用藥組凋亡率分別為(9.98±2.75)%、(16.57±3.43)%和(17.32±3.15)%，各組凋亡率均明顯高于同期空白對照組(3.25±1.08)%，20和40 μg/L濃度組差異有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)，且各用藥組的凋亡率隨著藥物劑量的增加而顯著升高,見圖3。

Figure 2. Vaccinium vitis procyanidin inhibited the growth of C6 cells observed under inverted microscope (×200).A：control group; B：10 μg/L group; C：20 μg/L group; D： 40 μg/L group.

Figure 3. Effects of Vaccinium vitis procyanidin on apoptosis of C6 glioma cells.

4 C6細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

免疫細胞化學結(jié)果顯示，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細胞72 h后，C6膠質(zhì)瘤細胞表達Bcl-2蛋白隨著藥物濃度升高而減少，而表達Bax蛋白增加，但均無明顯差異。計算Bax/Bcl-2比值發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度升高，兩者的比值明顯升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，且具有明顯的劑量依賴性，見圖4。

Figure 4. The changes of Bcl-2 and Bax protein expression in C6 cells after treated with Vaccinium vitis procyanidin (PC)(×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs 0 μg/L group.

5 Western blotting結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6膠質(zhì)瘤細胞72 h后，細胞表達Bcl-2蛋白減少，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，并隨著藥物濃度升高，表達量逐漸減少；細胞表達Bax蛋白也增加，與對照組比較，各藥物組差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。檢測細胞表達caspase-3蛋白發(fā)現(xiàn)，各藥物組細胞表達均增加，與空白對照組比較，20 μg/L越桔原花青素組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。計算Bax/Bcl-2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，各藥物組細胞的Bax/Bcl-2均明顯增加(P<0.01)，見圖5。

討 論

2007年北京市首次發(fā)布《全市健康狀況白皮書》指出，惡性腫瘤第1次位居疾病死亡原因首位。而腦腫瘤由于其地位的特殊性，成為嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。腦腫瘤大多數(shù)為膠質(zhì)瘤，且以惡性居多[4]，包括替莫唑胺在內(nèi)的多種療法對于患者生存期延長的意義不大[5]。有研究表明，這是由于在腫瘤發(fā)生過程中激活了腫瘤細胞的生長途徑和/或抑制了腫瘤細胞的凋亡途徑[6-8]。

腫瘤細胞在生長過程中由于凋亡信號轉(zhuǎn)導通路出現(xiàn)障礙，使它具有極強的生長能力。Bcl-2家族成員是腫瘤凋亡研究的熱點，研究表明，在線粒體膜上Bcl-2蛋白增多就會阻斷Bax等促凋亡蛋白的誘導凋亡作用，當降低Bcl-2蛋白表達時就會消除這種阻遏作用，使Bax等激活，線粒體膜上大孔通道開放，從而線粒體內(nèi)細胞色素C等蛋白釋放，促使凋亡發(fā)生[9-10]。在腫瘤細胞內(nèi)，當Bax/Bcl-2的比值增加也會引起腫瘤細胞凋亡[11]。在凋亡途徑中，caspase-3是效應(yīng)因子，是凋亡的執(zhí)行者，當線粒體蛋白釋放后就會使caspase-3活化裂解，使凋亡得以進行[12]。

本實驗研究了不同濃度的越桔原花青素對腦膠質(zhì)瘤細胞生長的作用，MTT結(jié)果顯示，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用24、48和72 h，均可以明顯地抑制C6細胞的生長，并且隨著藥物濃度的升高，細胞生長受抑制更加明顯；如果增加藥物作用的時間，也可以增加細胞生長的抑制作用(圖1)。當在倒置顯微鏡下觀察10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細胞72 h，與空白對照組比較，各藥物組細胞的密度隨著藥物濃度的升高而降低(圖2)。以上這些結(jié)果提示，越桔原花青素可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長，且這種作用具有劑量依賴性。流式分析術(shù)分析其凋亡率發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)球的凋亡率亦隨著藥物濃度的增加而明顯增加，也呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)(圖3)。這說明越桔原花青素可能誘導C6細胞凋亡而抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長，但機制不清。

為了研究誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡使生長受抑制的機制，本實驗繼續(xù)研究Bcl-2、Bax和caspase-3等相關(guān)凋亡蛋白的表達，細胞免疫組化和Western blotting結(jié)果表明，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細胞72 h后，細胞表達Bcl-2蛋白減少而表達Bax蛋白增加，Bax/Bcl-2的比值隨著藥物濃度升高而升高，并且細胞表達Bcl-2蛋白減少呈現(xiàn)濃度依賴性(圖4、5)。進一步檢測細胞表達caspase-3蛋白發(fā)現(xiàn)，各藥物組細胞表達caspase-3蛋白均增加，與空白對照組比較，20 μg/L越桔原花青素組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。并且由于越桔原花青素作用于C6膠質(zhì)瘤細胞后，通過線粒體路徑促使凋亡發(fā)生過程中，caspase-3活化是凋亡的下游事件，所以可能導致Bax/Bcl-2的結(jié)果與之不完全平行。

以上實驗結(jié)果說明，越桔原花青素可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長，并且通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達、下調(diào)Bcl-2表達，使Bax/Bcl-2的比值升高，增加促凋亡因素，最后促進下游效應(yīng)因子caspase-3的活化增加，從而使腫瘤細胞凋亡。有研究顯示，從葡萄籽中提取出來的原花青素低聚物雖可以使U87膠質(zhì)瘤細胞死亡，但其主要不是通過凋亡途徑來實現(xiàn)的[13]，所以在越桔原花青素抑制膠質(zhì)瘤細胞生長中是否有其它作用機制還需進一步研究。

[參 考 文 獻]

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