葉永賢， 林 洪， 沙 漠， 李招勝， 伍 磊， 馮文龍， 陳智彪， 丁真奇△

(廈門大學附屬東南醫院 1骨科, 2神經外科，福建 漳州 363000)

國際疼痛研究會將神經病理性疼痛(neuropathic pain, NPP)定義為：由于中樞或外周神經系統的直接損傷和功能紊亂引起的疼痛，它屬于一種慢性疼痛，主要表現為痛覺過敏、異常疼痛、感覺異常和自發性疼痛等臨床特征[1]。其發病率高，病因復雜，嚴重影響患者的生活質量，對神經病理性疼痛發生機制的研究已成為醫學界的前沿課題，具有重要的醫學和社會價值。既往研究表明，NPP與外周和中樞神經系統中復雜的分子機制密切相關。本研究擬通過建立慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury, CCI)模型，觀察CCI大鼠機械痛閾和熱痛閾的變化,測定CCI大鼠脊髓核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)、N-甲基D-天冬氨酸受體2B亞基(N-methyl-D-aspartic acid receptor 2B, NR2B)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達,旨在探討神經病理性疼痛的發病機制。

材 料 和 方 法

1 動物和主要試劑

SPF級雄性SD大鼠56只(由廈門大學實驗動物中心提供)，體重180～220 g，出生8～10周。實驗前大鼠適應環境1周，室溫22～24 ℃，保證12 h明暗交替光照，自由飲水攝食。根據體重從小到大排列按隨機數字表隨機分為sham組(n=8)和CCI組(n=48)。

Trizol總RNA提取試劑(Invitrogen)、組織RNA提取試劑盒(Omega)、第1鏈cDNA合成試劑盒(TaKaRa)和PCR擴增試劑盒(Taq)均購自上海生工生物工程股份有限公司；RIPA裂解液(強)、凝膠配置試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒(Beyontime)和聚偏二氟乙烯膜(polivinylidene fluoride, PVDF)膜(Millipore)購自福州升豐生物技術有限公司；NF-κBⅠ抗、NR2BⅠ抗和iNOSⅠ抗均購自廈門鷺隆生物科技發展有限公司。

2 主要方法

2.1CCI模型的建立 參考Bennett等[2]的方法結扎大鼠左側坐骨神經。Sham組僅暴露坐骨神經，不結扎；CCI組建立CCI模型。

2.2機械縮爪閾值(mechanical withdrawal threshold MWT;即50%縮爪閾值)測定 各組大鼠分別于術前1 d、術后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d以von Frey纖維測定機械痛閾。采用up-and-down的方法測定大鼠50%縮爪閾值。依次使用2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g、15.0 g和26.0 g的力度刺激后肢。開始時用4 g的力度刺激，若無縮腿反應，則選擇后一個力度6 g刺激后肢；若有縮足反應，則選擇前一個力度2 g刺激后趾。依此類推，在出現一次與前一次不同反應(有縮腿反應至無縮腿反應或者無縮腿反應至有縮腿反應)時，繼續依序刺激4次，包括以前的2次，一共6次，即可完成50%縮爪閾值的測定。50%縮爪閾值的計算公式：50% threshold (g)= 10logXf+kδ/10 000 (Xf為最后刺激所用力度，k為不同刺激方式的系數，在表中[3-4]查找，δ是指各刺激力度 (log值) 相鄰間距的平均數，此處δ=0.186)。

2.3熱刺激縮爪潛伏期(paw withdrawal latency,PWL)測定 選用中國醫學科學院生物醫學工程研究所研制生產的BME-410A型熱痛刺激儀，各組大鼠分別于術前1 d、術后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d使用以下方法測定熱痛閾值：將大鼠置于底為3 mm厚玻璃板的有機玻璃箱中，當大鼠安靜后，用熱輻射刺激儀(50 W, 20 V)發出5 mm光斑照射大鼠足底，電子秒表記錄從照射開始至大鼠出現抬腿回避時間即為PWL，注意照射時間不超過30 s，以免造成組織損傷，最長記為30 s。每只大鼠測量5次，間隔10 min，去掉最小值和最大值，計算3次PWL平均值。

2.4RT-PCR CCI組大鼠于術前1 d、術后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d測定痛閾后斷頭處死(n=4)，處死放光血液后取L4～L6脊髓組織于勻漿器中加入液氮研磨后，加入1 mL Trizol進行裂解，使用組織RNA提取試劑盒分離提取總mRNA。初步測定總mRNA濃度后，使用第1鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA模板，以反轉錄后的cDNA模板進行RT-PCR反應。BandScan軟件分析NF-κB、NR2B和iNOS mRNA的表達水平。并將NF-κB、NR2B和iNOS mRNA的表達進行相關性分析。RT-PCR引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2.5Western blotting CCI組大鼠于術前1 d、術后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d測定痛閾后斷頭處死(n=4)，取L4～L6脊髓組織于細胞裂解緩沖液中勻漿，分離提取總蛋白溶液。初步測定總蛋白濃度后，以40 μg蛋白在SDS-PAGE膠上電泳分離，之后轉印到PVDF上。用5%脫脂牛奶封閉2 h，在4 ℃條件下與Ⅰ抗孵育過夜(1∶1 000)，洗膜后于室溫下置入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗溶液(1∶10 000)中孵育1 h，最后用超敏ECL化學發光試劑盒顯像。Quantity one軟件分析NF-κB、NR2B和iNOS條帶的平均灰度值。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。MWT及PWL的數據采用成組t檢驗。RT-PCR和Western blotting的數據組內比較采用單因素方差分析及LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CCI模型的建立

Sham組大鼠CCI術后傷口未見感染，無異常滲出，肢體活動正常，無受限；CCI組大鼠術后自發性抬起左側肢體，不愿著地負重，患側出現跛行，有舔足、咬足和甩足現象，無一例發生感染和自噬傷殘肢體現象。

2 各組大鼠機械痛閾值變化

與sham組相比，CCI組術側從術后1 d開始出現MWT值下降(P<0.01)，術后7 d降至最低(P<0.01)。術后14 d時仍處于較低水平(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The change of mechanical withdrawal threshold in the rats with CCI of the sciatic nerve.Mean±SD.n=8.**P<0.01 vs sham.

3 各組大鼠熱痛閾值變化

與sham組相比，CCI組術側從術后1 d開始出現PWL值下降(P<0.01)，術后7 d降至最低(P<0.01)。術后14 d時仍處于較低水平(P<0.01)，見圖2。

4 RT-PCR檢測脊髓組織中NF-κB、NR2B和iNOS mRNA的表達

脊髓組織中NF-κB和NR2B mRNA的含量于損傷后1 d開始增加(P<0.01)；7 d達到高峰，與術前相比有顯著差異(P<0.01)。術后14 d雖有所降低，但仍維持在較高水平(P<0.01)。iNOS mRNA的表達于術后1d開始增加(P<0.01)，術后14 d達到高峰，顯著高于術前(P<0.01)，術后21 d時仍保持較高水平表達(P<0.01)，見圖3和表2。iNOS mRNA與NF-κB mRNA和NR2B mRNA的表達呈顯著正相關(r=0.842,P<0.05;r=0.833,P<0.05)。

Figure 2. The change of paw withdrawal latency in the rats with CCI of the sciatic nerve.Mean±SD.n=8.**P<0.01 vs sham.

Figure 3. The mRNA expression of NF-κB, NR2B and iNOS in the spinal cord of the rats with CCI of the sciatic nerve detected by RT-PCR.

表2 CCI組大鼠術后各時點NF-κB、NR2B和iNOS mRNA的表達

5 Western blotting檢測脊髓組織中NF-κB、NR2B和iNOS蛋白的表達

脊髓NF-κB和NR2B 的蛋白含量于損傷后1 d開始增加(P<0.01)；7 d達到高峰，與術前1 d相比有顯著差異(P<0.01)，術后14 d雖有所降低，但仍維持在較高水平(P<0.01)。脊髓iNOS 蛋白表達于術后1 d開始增加(P<0.01)，術后14 d達到高峰，顯著高于術前(P<0.01)，術后21 d時仍保持較高水平表達(P<0.01)，見圖4。

Figure 4. The relative protein levels of NF-κB, NR2B and iNOS in the spinal cord of the rats with CCI of the sciatic nerve detected by Western blotting. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs -1 d.

討 論

國際疼痛研究學會的神經病理性疼痛專家研究小組(Neuropathic Pain Special Interest Group of the International Association for the Study of Pain, Neu-PSIG)對神經病理性疼痛的最新定義是：軀體感覺系統的疾病或病變直接引起的疼痛[5]。NPP在給患者帶來極大的生理和心理折磨的同時，也帶來了嚴重的社會壓力。NPP是多因素參與的緊密聯系的過程，對諸多參與機制間的相互關系進行研究意義重大，其發生發展過程中分子機制的闡明，有助于開發針對NPP的新的治療方法。

NPP的主要行為學特征是自發性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛。其動物模型構建的方法較多，各有優缺點。本研究采用的是CCI神經病理性疼痛動物模型，其致病機制是大鼠對鉻制腸線特異性的免疫反應，引起神經干腫脹，進而出現神經壓迫和神經干部分切斷，從而導致神經病理性疼痛的表現。實驗發現，手術組術側MWT和PWL顯著下降，提示CCI大鼠出現機械痛敏和熱痛敏。表明適度的坐骨神經結扎選擇性損傷了有髓鞘的粗纖維，保留了大部分傳遞痛覺的C纖維，標志CCI模型成功建立。

NF-κB是一種重要的核轉錄因子，位于胞質中以p50/p56異二聚體的形式存在，平時與抑制性蛋白IκB結合而呈現非活性狀態。被多種刺激劑激活后，NF-κB與IκB解離后轉位入核與靶基因啟動子/增強子上的κB位點結合。參與調節多種靶基因包括炎癥因子和疼痛介質等的表達，NF-κB與其下游的炎癥因子一同參與了神經病理性疼痛的產生[6]。在神經損傷誘導疼痛的大鼠脊髓組織中NF-κB活化并直接參與疼痛發展。

NMDA受體在神經病理性疼痛的神經元機制和膠質-免疫機制的發生發展中承擔著調節突觸間信號傳播，加速神經元變性和參與神經元-膠質細胞間信息通訊等重要作用。NR2B作為NMDA受體的調節性亞基，決定著NMDA受體的一系列重要特性。研究表明，神經病理性疼痛時，痛覺傳入神經元末梢在脊髓中釋放大量的谷氨酸，通過激活NMDA受體，提高痛覺傳遞神經元的興奮性；與此同時，經NMDA受體內流的Ca2+激活鄰近的NOS，NOS合成的一氧化氮(nitric oxide, NO)可透過細胞膜彌散至突觸前膜加速谷氨酸的釋放，促進疼痛的產生。

NO作為一種多功能的信使分子最早被認為具有血管內皮舒張作用。在機體內發揮著諸如調節免疫和炎癥反應、阿片耐受和神經傳導等作用[7]。受損神經相應脊髓節段的NOS在疼痛的調節中發揮著重要作用。既往研究表明，在中樞神經系統中，NO的合成主要是由NMDA受體的激活而觸發的。同時亦有文獻表明，iNOS啟動子上有NF-κB結合位點，iNOS的表達受NF-κB在轉錄上調控。

實驗發現，CCI組MWT和PWL于術后1 d開始下降，在7 d時達到高峰；與術前相比，NF-κB于術后1 d開始增加，7 d時達到高峰，14 d和21 d時仍維持較高表達。其變化與CCI大鼠痛覺過敏程度關系密切，證實NF-κB在神經病理性疼痛的發生和發展中有重要的作用。NR2B參與體內許多復雜的生理和病理過程，不僅包括長時程增強、學習記憶、細胞壞死和凋亡等[8]，而且還在痛敏的產生和維持方面起關鍵作用[9]。本實驗采用CCI模型，術后7 d和14 d大鼠痛閾明顯低于sham組，并且RT-PCR和Western blotting發現的脊髓NR2B表達增加。疼痛行為、痛閾值下降和脊髓NR2B表達增加具有統一性。說明外周傷害性刺激可引起脊髓NR2B表達增加，是導致CCI大鼠神經病理性疼痛的重要因素之一。與sham組相比，CCI組iNOS mRNA水平于術后14 d達到高峰，在21 d時仍維持較高水平。iNOS的表達高峰較NF-κB、NR2B及疼痛高峰的延遲現象，提示iNOS可能不參與慢性疼痛的觸發和啟動，而與慢性疼痛的長期維持有關。通過對RT-PCR和Western blotting結果進行相關性分析也表明，iNOS的表達與NF-κB和NR2B的表達呈正相關。CCI大鼠痛覺過敏在術后14 d以后仍維持在較高水平，與脊髓iNOS大量表達有關，可能是激活的NF-κB上調iNOS表達，參與神經元細胞的Ca2+過載引起神經元細胞的凋亡。同時可能包括了NR2B-NOS信號通路[10]的協同作用。

綜上所述，CCI術后大鼠脊髓中NF-κB、NR2B及下游iNOS表達增加，可能與神經病理性疼痛的產生和維持有關。

[參 考 文 獻]

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