內源性組胺減輕小鼠前腦缺血再灌注后期腦損傷*

范彥英, 馬云鵬， 喬 圓， 何 萍， 張軒萍， Hiroshi OHTSU， 陳 忠

(1山西醫科大學基礎醫學院藥理教研室，山西 太原 030001； 2浙江大學醫學部，浙江 杭州 310058；3浙江大學醫學院附屬第二醫院，浙江 杭州 310009； 4東北大學醫學院，日本 仙臺 980-8775)

中樞組胺是腦內的一種神經遞質或調質，其可由組氨酸經組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase, HDC)脫羧而成[1]。腦內組胺主要分布于組胺能神經元和肥大細胞中。組胺能神經元胞體位于下丘腦結節乳頭核，該神經元在腦內有著廣泛而彌散的投射。組胺在腦內通過作用于H1、H2和H3受體發揮著多種神經調節作用，如參與攝食、運動功能、學習記憶等生理過程。

近年來的研究發現，中樞組胺能神經系統對腦缺血早期的神經損傷發揮重要調節作用。Adachi 等[2]在大鼠全腦缺血模型上，觀察到α-氟甲基組氨酸(α-fluromethylhistidine,α-FAM;一種選擇性的HDC 抑制劑)可加重缺血72 h 海馬CA1 區的神經元死亡，而外源性給予組胺則能減輕沙鼠前腦缺血再灌7 d后的神經元損傷[3]。進一步的研究表明，H2受體可能參與了組胺的這種神經保護作用。側腦室內注射組胺H2受體拮抗劑ranitidine或cimetidine都會加重腦缺血再灌注損傷[3]。而給予組胺H2受體激動劑dimaprit則可減輕大鼠全腦缺血引起的神經元損傷[4]。課題組的前期研究發現，在培養的皮層神經元上，組胺預處理能對抗NMDA 急性處理誘發的興奮性損傷，而這種作用是通過H2受體/cAMP/PKA通路介導的[5]。最近的研究還發現，組胺還可能通過激動組胺H1受體上調星形膠質細胞上的谷氨酸轉運體1(glutamate transporter 1, GLT-1)和谷氨酰胺合成酶的表達來減輕腦缺血再灌急性期的神經損傷[6-7]。這些證據均提示，組胺在腦缺血早期具有腦保護作用。但是，目前關于組胺抗腦缺血的研究主要集中評價了其在腦缺血早期(7 d以內)所扮演的角色，且多采用藥理學手段，即外源性給予組胺或α-FMH及組胺受體拮抗劑。而內源性組胺對腦缺血后期(數周)的學習記憶功能及神經元損傷的影響尚不明確。

為此，本實驗利用C57BL/6野生型(wild-type,WT)小鼠和組氨酸脫羧酶基因敲除(HDC-KO)小鼠(該小鼠由于無法將組氨酸脫羧為組胺，體內長期缺乏組胺[8])，來探討內源性組胺對前腦缺血再灌后期條件性恐懼記憶和神經元損傷的影響。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性C57BL/6 WT小鼠(北京維通利華公司提供)和HDC-KO小鼠(從日本Ohtsu教授研究組引進)，體重22～25 g，周齡為8～10周。從2種基因型小鼠中各隨機抽取3只，提取小鼠尾部組織DNA，用PCR對動物的HDC基因和neomycin基因進行擴增鑒定。擴增HDC基因的引物序列為5′-AGTGAGGGACTGTGGCTCCACGTCGATGCT-3′ 和5′-TACAGTCAAAGTGTACCATCATCCACTTGG-3′ ，擴增產物為147 bp；擴增neomycin基因的引物序列為5′-AAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGG-3′和5′-ATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGC-3′，擴增產物為244 bp。所有的動物實驗均遵照國家實驗動物飼養和使用指南，動物飼養在溫度控制的環境[(22±1)℃]下，12 h明暗循環，自由飲食。

2 方法

2.1前腦缺血模型制備 將WT和HDC-KO小鼠各隨機分為對照組和缺血組，參照文獻[9]，以1%的戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，鈍性分離小鼠雙側頸總動脈，并利用動脈瘤夾進行夾閉，缺血30 min后再灌，并縫合傷口。對照組僅分離但不夾閉雙側頸總動脈。動物在手術時和能自主活動前利用小動物保溫毯保溫，肛溫均保持在36.5～37.5 ℃之間。

2.2體重監測 在缺血前以及缺血后第1天到第7天及第14天對小鼠進行稱重，并做記錄。

2.3條件性恐懼記憶的測定 在前腦缺血再灌14 d時，對小鼠進行條件性恐懼記憶的檢測。將小鼠放入訓練盒內，經過120 s的適應后，給予30 s的2.8 kHz，84 dB的聲音刺激(條件刺激)，在聲音刺激的最后2 s，同時給予1 mA的電流刺激(非條件刺激)，刺激結束30 s后將小鼠從訓練盒內拿出。在訓練后24 h，分別對每只小鼠進行背景和線索記憶的測試，按照訓練時的順序，依次將每只小鼠放入訓練盒內，不給予任何刺激，觀察300 s內出現恐懼反應(free-zing；即一種除呼吸運動外，全身其它軀體運動全部停止的狀態)的次數。之后再依次將小鼠放入一個新的盒子，適應120 s后，給予300 s的聲音刺激(2.8 kHz，84 dB)，但不給予電流刺激，觀察后300 s內出現恐懼反應的次數。恐懼反應的次數通過計數300 s內每5 s恐懼反應的出現與否而得到。動物恐懼反應的程度最終以恐懼反應出現的次數與觀察次數60的百分比來表示。

2.4病理切片及甲苯胺藍染色 前腦缺血再灌3 d及15 d，各組小鼠于1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉下經左心室插管灌流。灌流液依次采用生理鹽水及4%多聚甲醛固定液。取出固定后的大腦置于同一固定液中進行后固定24 h，后以30%蔗糖溶液脫水1周。使用冰凍切片機制備厚度為10 μm的海馬冠狀切片。切片室溫放置過夜晾干，0.01 mol/L PBS洗5 min，重復3次；1%甲苯胺藍染色20 min；1%鹽酸乙醇分化3～10 s；以95%、100%乙醇脫水各2 min，二甲苯透明，封片，對海馬CA1區的正常神經元進行計數。

3 統計學處理

數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示。采用SPSS 15.0軟件處理，組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)或t檢驗，動物死亡率的比較采用似然比2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 實驗動物的HDC基因和neomycin基因的PCR擴增鑒定結果

如圖1所示，WT小鼠在147 bp處出現較強的HDC基因PCR擴增條帶，而在244 bp附近則沒有出現條帶。相反，HDC-KO小鼠在WT小鼠應出現HDC基因PCR擴增條帶的相應位置(147 bp處)并沒有出現任何條帶，而在244 bp附近出現neomycin替代基因的PCR擴增條帶，證明我們所用的HDC-KO小鼠的HDC基因確實已被敲除，取而代之的是插入的neomycin基因，且為純合子。

Figure 1. Genotype identification of the mice by PCR. WT mice tested displayed a 147-bp band corresponding to the HDC gene fragment, whereas all HDC-KO mice tested showed a 244-bp band corresponding to the neomycin gene fragment.

2 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌后不同時點的死亡率

小鼠前腦缺血再灌后的1～7 d，WT與HDC-KO小鼠均出現了死亡情況，但死亡率并無明顯差異；再灌后的8～14 d，剩余的8只WT小鼠均存活，而剩余的9只HDC-KO小鼠中的3只死亡，其死亡率顯著高于WT小鼠(P<0.05),見表1。

3 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌后不同時點的體重變化

對再灌14 d 時仍存活的動物的體重進行統計分析，結果發現，前腦缺血再灌1 d 后，WT和HDC-KO小鼠的體重，與造模前相比均出現了明顯下降,但2組間的體重變化程度尚無明顯差異。再灌2 d 后，WT小鼠的體重開始逐漸恢復，而HDC-KO小鼠體重在再灌 4 d 后開始恢復。HDC-KO小鼠的體重恢復程度(即測量當天與造模前體重的差值)在再灌4 d、5 d、6 d 及7 d 后均顯著低于WT小鼠，在再灌14 d 后仍有低于WT小鼠的趨勢，但無顯著差異,見圖2。

表1 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌后不同時點的死亡率

Figure 2. The changes of body weight at different time points after forebrain ischemia/reperfusion in WT and HDC-KO mice. The animals were applied with 30 min of bila-teral common carotid artery occlusion, and the body weight was observed at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 14 d after reperfusion. The change of body weight is equal to the current body weight minus the body weight before ischemia.Mean±SEM. WT, n=8; HDC-KO, n=6. *P<0.05, ** P<0.01 vs WT.

4 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌14 d的條件性恐懼記憶變化

在前腦缺血再灌14 d 時，對WT與HDC-KO小鼠進行了條件性恐懼記憶的檢測，結果如圖3所示，WT和HDC-KO小鼠的對照組，其背景和線索記憶能力并無明顯差異。與相應的對照組相比，WT和HDC-KO缺血組小鼠的背景和線索記憶能力均出現明顯下降，但HDC-KO小鼠的背景和線索記憶能力均顯著低于與WT小鼠(P<0.05)。

Figure 3. Fear conditioning at 14 d after forebrain ischemia/reperfusion in HDC-KO and WT mice. The animals were applied with 30 min of bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). A: contextual memory; B: cue memory. Mean±SEM. WT sham, n=6; HDC-KO sham, n=6; WT BCCAO, n=8; HDC-KO BCCAO, n=6. *P<0.05 vs WT sham; ##P<0.01 vs HDC-KO sham; △P<0.05 vs WT BCCAO.

5 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌3 d 及15 d 的海馬CA1區神經元密度變化

在前腦缺血再灌 3 d 及 15 d 后WT與HDC-KO組小鼠腦片的甲苯胺藍染色結果見圖4，對照組的WT與HDC-KO小鼠的海馬CA1區神經元密度無明顯差異。前腦缺血再灌 3 d 后，與對照組相比，WT和HDC-KO小鼠的的缺血組均出現明顯的海馬CA1區神經元丟失，但兩缺血組小鼠的神經元密度未見顯著差異，而再灌15 d 后，HDC-KO組神經元的缺失更為嚴重，神經元計數統計結果顯示其神經元密度，明顯低于WT小鼠(P<0.05)。

Figure 4. The hippocampal CA1 neuronal density at 3 d and 15 d after forebrain ischemia/reperfusion in HDC-KO and WT mice. The animals were applied with 30 min of bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). A：the representative images of CA1 sector stained with toluidine blue. Scale bar=50 μm. B: quantitative evaluation of CA1 neuronal density at 3 d (n=6). C: quantitative evaluation of CA1 neuronal density at 15 d (WT sham, n=6; HDC-KO sham, n=6; WT BCCAO, n=8; HDC-KO BCCAO, n=6). Each value is expressed as percentages of the cell numbers in WT sham group. Mean±SEM. *P<0.05 vs WT sham; #P<0.05, ## P<0.01 vs HDC-KO sham; △P<0.05 vs WT BCCAO.

討 論

本實驗利用HDC-KO小鼠研究了內源性組胺對前腦缺血再灌后期腦損傷的調節作用，實驗結果表明，內源性組胺對前腦缺血再灌注損傷后期的學習記憶能力及神經元損傷具有明顯改善作用。

組胺在腦缺血再灌早期的保護作用已經被證實[2-4]。腦缺血后動物體重下降的程度可以部分反映腦缺血損傷的嚴重程度[10-11]。已有的研究表明，中樞組胺可抑制小鼠攝食并降低體重，該作用可被H1受體拮抗劑所逆轉[12-13]。相似地，在H1受體敲除小鼠會表現為攝食過量和肥胖[14]。此外，組胺H3受體拮抗劑可通過反向調節H3受體增加組胺的合成與釋放，進而抑制體重增加[15]。在本研究中，缺乏內源性組胺的HDC-KO小鼠在腦缺血再灌2 d后的體重恢復程度低于WT小鼠，到4 d后出現顯著差異，提示內源性組胺在腦缺血再灌早期可能通過其神經保護作用間接加速了體重的恢復，而非直接增加動物體重。然而，WT和HDC-KO小鼠在再灌3 d后的海馬CA1區的神經元密度及再灌1～7 d 內的死亡率并未見顯著差異。本課題組在前期研究中也發現，WT和HDC-KO小鼠在短暫性或永久性局灶性腦缺血 1 d 后的腦梗死體積沒有顯著差異[16-17]。這些與以往研究相矛盾的結果可能是由于HDC-KO小鼠腦內長期缺乏組胺，體內出現的代償機制能夠部分代償腦缺血急性期內源性組胺對神經損傷的調節作用所造成的。

在腦缺血再灌后期，HDC-KO小鼠仍有33%的動物死亡，而WT小鼠未出現動物死亡，與此同時，在再灌 15 d 后，HDC-KO小鼠的海馬CA1區神經元缺失比WT小鼠更為嚴重，提示內源性組胺對腦缺血再灌后期的神經元損傷具有抑制作用。腦缺血再灌注引發神經元損傷的同時往往伴隨著學習記憶功能的下降[18-20]。盡管HDC-KO小鼠的學習記憶功能在多種不同的學習記憶模型中都發生了改變[21]，但在本實驗中，WT和HDC-KO小鼠對照組的條件恐懼記憶能力并未見顯著差異，而前腦缺血再灌14 d后，HDC-KO小鼠條件恐懼記憶能力的下降比WT小鼠更為嚴重，提示內源性組胺對腦缺血后期的學習記憶能力有明顯改善作用。

內源性組胺改善腦缺血后期神經損傷及學習記憶功能的作用可能與其在缺血早期發揮的抑制興奮性神經毒性作用有關。在局灶性腦缺血中發現，組胺可通過H2受體抑制谷氨酸的釋放[4, 22]。本課題組在培養的皮層神經元上發現，組胺能保護NMDA誘發的興奮性損傷作用，而這種作用通過組胺H2受體所介導[5]。另外，組胺還可通過組胺H1受體促進星形膠質細胞上的谷氨酸轉運體GLT-1和谷氨酰胺合成酶的表達，進而減少細胞外的谷氨酸濃度，從而減輕腦缺血早期發生的興奮性毒性損傷[6-7]。另外，本課題組最近的研究發現，低氧預處理誘導釋放的內源性組胺可促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達[17]。而VEGF對腦缺血后期的神經損傷和修復具有重要調節作用[23-25]。我們推測，組胺在腦缺血再灌后期還可能通過調節VEGF表達，減輕神經損傷并促進腦功能恢復。因此，內源性組胺調節腦缺血再灌注損傷的保護機制可能是多方面的。

綜上所述，本研究利用HDC-KO小鼠發現內源性組胺可改善腦缺血長期再灌注后的學習記憶功能，并減少神經元損傷，但其具體機制還有待更深入的研究。

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