趙 麗， 郭云良

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院腦血管病研究所，山東 青島 266003)

髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種具有重要功能的髓鞘結(jié)構(gòu)蛋白[1]，位于髓鞘漿膜面，與髓鞘脂質(zhì)緊密結(jié)合，利于穩(wěn)定中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的結(jié)構(gòu)和功能[2]，且具有神經(jīng)組織特異性[3]。MBP缺乏將會(huì)導(dǎo)致髓鞘形成障礙，其水平變化可以反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷及髓鞘損傷的嚴(yán)重程度[4]，足量的MBP對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)非常重要[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明[6]，正常成年大鼠腦內(nèi)有少量的MBP mRNA的表達(dá)，腦缺血損傷早期MBP mRNA[7]和MBP蛋白[8]表達(dá)降低，并且降低程度具有時(shí)間依賴性[9]。但隨著缺血時(shí)間的推移，MBP mRNA的表達(dá)緩慢上升，在第7天表達(dá)明顯高于損傷后第1天的表達(dá)量。段建剛等[10]研究表明，針刺治療能上調(diào)MBP表達(dá)，促進(jìn)髓鞘的再生。胡黃連苷Ⅱ的抗氧化、抗炎、抗凋亡作用已經(jīng)得到證實(shí)[11-12]，但具有神經(jīng)保護(hù)作用的中藥活性成分能否影響MBP表達(dá)水平，迄今尚未見報(bào)道。本課題組的前期工作從大鼠神經(jīng)行為功能、腦梗死體積和免疫組化染色等方面，探討胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血再灌注損傷劑量和時(shí)間窗，發(fā)現(xiàn)在腦缺血1.5 h，腹腔注射胡黃連苷Ⅱ 20 mg/kg時(shí)其腦保護(hù)作用最強(qiáng)[13-14]。鑒于神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)和免疫組化染色受主觀因素影響較大，結(jié)果難免存在局限性。本次實(shí)驗(yàn)試圖應(yīng)用多種生物學(xué)方法定性及定量地檢測(cè)腦組織中MBP表達(dá)水平及髓鞘的結(jié)構(gòu)變化，深入探討胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的作用及其最佳治療劑量和時(shí)間窗。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物模型

成年健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠200只，體重230～250 g，青島市藥物檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(魯)20100010]。動(dòng)物置實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1周，自由進(jìn)食、飲水；室溫(23±2) ℃，自然光照。隨機(jī)抽取5×3只為對(duì)照組，其余185只用于建立腦缺血模型。術(shù)前動(dòng)物禁食12 h，經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)，仰臥固定、無(wú)菌操作，頸部正中切口，分離并結(jié)扎雙側(cè)經(jīng)總動(dòng)脈(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)建立前腦缺血模型[15-16]，術(shù)中保持動(dòng)物肛溫36～37 ℃。術(shù)后2 h仍未蘇醒或死亡的26只動(dòng)物剔除，成模共159只納入統(tǒng)計(jì)范圍。對(duì)照組大鼠不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其余操作同實(shí)驗(yàn)組。

2 設(shè)計(jì)分組和干預(yù)措施

將成功造模的159只動(dòng)物隨機(jī)分為模型組(5×3只)和治療組(16×3×3只)，治療組按二因素四水平[L16(45)]正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理分組。治療時(shí)間窗為A因素，設(shè)缺血1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h 4個(gè)水平；治療劑量為B因素，設(shè)5、10、20和40 mg/kg 4個(gè)水平。正交試驗(yàn)重復(fù)3次。

胡黃連苷Ⅱ，純度>98%，分子式：C23H28O13，粉劑由天津奎青醫(yī)藥公司提供，按照大鼠體重秤取相應(yīng)劑量的胡黃連苷Ⅱ粉劑，應(yīng)用等滲鹽水溶解稀釋成1 mL溶液，按照[L16(45)]正交設(shè)計(jì)，在相應(yīng)的缺血時(shí)間腹腔注射不同濃度的胡黃連苷Ⅱ溶液各1 mL。對(duì)照組和模型組與術(shù)后2 h腹腔注射等量等滲鹽水。

3 標(biāo)本采集

3.1石蠟切片 治療后24 h，隨機(jī)取對(duì)照組5只、模型組5只和治療組16×3只大鼠，以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟依次灌注生理鹽水200 mL和4%多聚甲醛200 mL，完整取腦，置4%甲醛溶液中固定2 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，厚度5 μm，貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上，4 ℃保存。

3.2總蛋白提取 治療后24 h，隨機(jī)取對(duì)照組5只、模型組5只和治療組16×3只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL，開顱取腦，切取缺血腦組織200 mg，迅速置1.5 mL EP管中，按1∶4比例加細(xì)胞裂解液(500 μL裂解液+5 μL PMSF，No. P0013，碧云天生物技術(shù)研究所)，超聲波勻漿，4 ℃冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5801型)10 949×g離心10 min，去沉淀組織留上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，-20 ℃保存。

3.3RNA提取 治療后24 h，隨機(jī)取對(duì)照組5只、模型組5只和治療組16×3只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL，開顱取腦，切取缺血腦組織200 mg，放入1.5 mL EP管，加1 mL RNA-Solv Reagent，剪碎研磨，超聲振蕩30 s，室溫放置5 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清置另一EP管，加0.2 mL氯仿，蓋緊離心管，振蕩混勻15 s，冰上放置10 min，4 ℃、12 000×g離心15 min；取無(wú)色水相置于EP管中，并加入0.5 mL異丙醇，輕輕混勻，冰上放置10 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，小心棄上清；加75%乙醇1 mL洗滌沉淀，渦旋混勻，4 ℃、7 500×g離心5 min，小心棄上清；通風(fēng)櫥干燥15～30 min(沉淀由白色變?yōu)橥该鞣娇?，加0.1% DEPC水30 μL后置于57 ℃水浴中10 min；室溫靜置后，紫外分光光度計(jì)(Bekamann DU640)測(cè)定RNA純度和豐度，-20 ℃保存。

4 觀察指標(biāo)

4.1固綠髓鞘染色 切片常規(guī)脫蠟入水，經(jīng)95%乙醇處理1 min后置于固綠乙醇溶液，37 ℃染色1 h，95%乙醇洗10 s×2次，蒸餾水洗15 s×3次，0.3%碳酸鋰分色10 s×2次，蒸餾水洗15 s×3次，核固紅復(fù)染90 s，蒸餾水沖洗后常規(guī)脫水、透明、封固。光鏡下正常髓鞘呈條索狀，深綠色，排列緊密，細(xì)胞呈紅色。在400倍光鏡下選取頂葉腦白質(zhì)區(qū)5個(gè)不重疊的視野，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，取均值。以髓鞘染色灰度值(dyeing gray value，DGV)表示髓鞘變化情況。

4.2免疫組化染色 兔抗鼠MBP Ⅰ抗、鏈霉親和生物素辣根過氧化物酶(SABC)試劑盒、3,3-二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色試劑盒均由武漢博士德生物公司提供。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，按SABC試劑盒說明書步驟操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察髓鞘呈棕黃色條索狀，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)著色不均勻，呈空泡狀。陰性對(duì)照切片不加Ⅰ抗以0.01 mol/L PBS替代染色，不出現(xiàn)陽(yáng)性著色。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察大腦缺血腦白質(zhì)區(qū)5個(gè)不重疊的視野，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，取均值。以髓鞘免疫組化灰度值(immunohistochemical gray value，IGV)表示MBP表達(dá)程度。

4.3Western blotting檢測(cè) 制備12%分離膠，5%濃縮膠，先后在75 V、120 V電壓下電泳，獲得目的條帶(MBP分子量：18 kD，23 kD)，360 mA轉(zhuǎn)膜40 min，磷酸鹽-吐溫緩沖液(phosphate buffered saline with Tween-10，PBST)洗膜5 min×3次，然后加MBP兔抗大鼠Ⅰ抗(Abcam)孵育2 h，PBST洗滌Ⅰ抗10 min×3次，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗(北京中杉金橋)孵育1 h，PBST洗滌5 min×3次，PBS 5 min×3次清洗后顯影。將膜置于A、B混合顯影液中，用Bio-Rad 2000型凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。以同一標(biāo)本β-actin(42 kD)的灰度值作為內(nèi)參照，校正目的蛋白灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)值(relative value of protein, RVP)：樣品灰度值/β-actin灰度值。重復(fù)測(cè)定3次。

4.4RT-PCR檢測(cè) (1) 引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(上海英濰捷基有限公司合成)。MBP上游引物5’-CCC ATT GGT GCA CAC TAA CCT-3’，下游引物5’-CGA CTT GAT TCA GCG ACA GGA-3’，片段長(zhǎng)度103 bp。內(nèi)參照GAPDH上游引物5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3’，下游引物5’-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3’，片段長(zhǎng)度110 bp。(2) 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA體系25 μL：Oligo(dT) 2 μL，RNA 2 μg，DEPC-H2O補(bǔ)至13.4 μL。混勻后置于70 ℃ 5 min，冰浴5 min后，加入以下物質(zhì)：M-MLV RT 5×5 μL，dNTP Mixture 5 μL，RNase inhibitor 0.62 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL。混勻后42 ℃ 1 h，70 ℃反應(yīng)15 min，-20 ℃保存。(3) PCR體系50 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，cDNA 1 μL，primer 1 (10 μmol/L) 1 μL，primer 2 (10 μmol/L)1 μL，Taq聚合酶 0.4 μL，0.1% DEPC-H2O補(bǔ)至50 μL。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 3 min。(4)電泳：RT-PCR體系50 μL，加6×DNA loading buffer 10 μL 振蕩混勻，離心5 s，上樣10 μL。選取適合的DNA Marker 2 μL上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V、100 mA)30 min，溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測(cè)各條帶灰度值，以目的基因與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值，表示目的基因的相對(duì)豐度(relative content of mRNA，RCM)。重復(fù)測(cè)定3次。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行多組數(shù)據(jù)之間差異的比較，多重比較運(yùn)用最小顯著差異(least significant difference，LSD)法。根據(jù)不同缺血(給藥)時(shí)間和劑量以及缺血時(shí)間和劑量的交互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)是否有顯著影響，得出最佳的劑量和時(shí)間窗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組固綠染色髓鞘呈條索狀，深綠色，排列緊密。造模后，髓鞘疏松，染色變淺，膠質(zhì)細(xì)胞空泡形成。DGV、IGV、MBP蛋白含量(RVP)和MBP mRNA豐度(RCM)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。經(jīng)胡黃連苷Ⅱ治療后，DGV、IGV、RVP和RCM較模型組均顯著升高(P<0.05),見表1和圖1～4。正交試驗(yàn)各指標(biāo)結(jié)果如表2所示，表中所列數(shù)據(jù)均為3次正交試驗(yàn)的均值，表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和SS為固綠髓鞘染色MGV方差分析數(shù)據(jù)，其余方差分析指標(biāo)數(shù)據(jù)從略。

表1 檢測(cè)結(jié)果

表2 L16 (45)正交表及檢測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果分析

2.1固綠髓鞘染色 由圖1和表2可見，自變量因素A(時(shí)間)的不同水平對(duì)髓鞘損傷有顯著影響(P<0.01)，而因素B(劑量)和因素C (時(shí)間-劑量交互作用)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即給藥時(shí)間對(duì)腦缺血后髓鞘損傷程度有顯著的影響，而給藥劑量無(wú)顯著影響，時(shí)間-劑量交互作用可忽略不計(jì)。LSD法對(duì)不同水平進(jìn)行兩兩比較得LSD值，給藥時(shí)間各組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥劑量5 mg/kg(B1)和10 mg/kg(B2)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從治療時(shí)間窗最大化和用藥劑量最小化的角度綜合考慮，以A3B2組合最好，即最佳治療時(shí)間窗和劑量分別為缺血2.0 h腹腔注射10 mg/kg。

Figure 1. The myelin in parietal white matter of rats (fast green staining,×400).Normal nerve fiber myelin was dark green and cord-like, tightly packed (→), and the nucleus was red (▲). After modeling, myelin fibers were uncolored, loose (white arrows) and vacuolated (★).Mean±SD.n=5.#P<0.05 vs control;*P<0.05 vs model.

2.2免疫組化染色 由圖2和表2可見，自變量因素A(時(shí)間)的不同水平對(duì)髓鞘表達(dá)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B(劑量)和時(shí)間-劑量交互作用(C)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即給藥時(shí)間對(duì)腦缺血后髓鞘表達(dá)有顯著影響，而給藥劑量以及給藥時(shí)間和給藥劑量的交互作用可以忽略不計(jì)。兩兩比較LSD值顯示，給藥時(shí)間1.0 h(A1)和1.5 h(A2)、1.0 h(A1)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.5 h(A4)、2.0 h(A3)和2.5 h(A4)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥劑量均無(wú)顯著差異。綜合考慮A3B2組合最好，即最佳治療時(shí)間窗和劑量分別為缺血2.0 h和10 mg/kg。

2.3Western blotting定量檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞MBP表達(dá)水平 如圖3和表2所示，各組大鼠有不同數(shù)量的蛋白表達(dá)，且治療組表達(dá)量顯著高于模型組。方差分析顯示，自變量因素A(時(shí)間)的不同水平對(duì)MBP蛋白表達(dá)的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B(劑量)和時(shí)間-劑量交互作用(C)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩兩比較LSD值顯示，給藥時(shí)間1.0 h(A1)和1.5 h(A2)、1.0 h(A1)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.5 h(A4)、2.0 h(A3)和2.5 h(A4)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥劑量均無(wú)顯著差異。綜合考慮A3B2組合最好，即最佳治療時(shí)間窗和劑量分別為缺血2.0 h和10 mg/kg。

Figure 2. The myelin in parietal white matter of the rats (SABC staining,×400).In control group, myelin packed closely and tidy (→). After modeling, myelin became loose and disordered (white arrows), and the positive cells were unevenly colored and vacuolated (▲). Mean±SD.n=5.#P<0.05 vs control;*P<0.05 vs model.

Figure 3. The effects of picroside Ⅱ on the expression of MBP after cerebral ischemia injury.C: control; M: model; 1～4: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 1.0 h; 5～8: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 1.5 h; 9～12: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 2.0 h; 13～16: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 2.5 h; 1, 5, 9 and 13: intraperitoneal injection of 5 mg/kg picroside Ⅱ; 2, 6, 10 and 14: intraperitoneal injection of 10 mg/kg picroside Ⅱ; 3, 7, 11 and 15: intraperitoneal injection of 20 mg/kg picroside Ⅱ; 4, 8, 12 and 16: intraperitoneal injection of 40 mg/kg picroside Ⅱ.Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs C;*P<0.05 vs M.

2.4RT-PCR檢測(cè)腦組織MBP mRNA水平 如圖4和表2所示，各組大鼠轉(zhuǎn)錄水平不同，治療組大鼠mRNA較模型組升高。方差分析顯示，自變量因素A(時(shí)間)的不同水平對(duì)MBP mRNA表達(dá)的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B(劑量)和時(shí)間-劑量交互作用(C)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩兩比較LSD值顯示，給藥時(shí)間1.0 h(A1)和1.5 h(A2)、1.0 h(A1)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.5 h(A4)、2.0 h(A3)和2.5 h(A4)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1.0 h(A1)和2.5 h(A4)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥劑量各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜合考慮A2B3組合最好，即最佳治療時(shí)間窗和劑量分別為缺血1.5 h和20 mg/kg。

Figure 4. The effects of picroside Ⅱ on the mRNA expression of MBP after cerebral ischemia injury.C: control; M: model; 1～4: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 1.0 h; 5～8: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 1.5 h; 9～12: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 2.0 h; 13～16: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 2.5 h; 1, 5, 9 and 13: intraperitoneal injection of 5 mg/kg picroside Ⅱ; 2, 6, 10 and 14: intraperitoneal injection of 10 mg/kg picroside Ⅱ; 3, 7, 11 and 15: intraperitoneal injection of 20 mg/kg picroside Ⅱ; 4, 8, 12 and 16: intraperitoneal injection of 40 mg/kg picroside Ⅱ.Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs C;*P<0.05 vs M.

討 論

正交表能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，在減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)的同時(shí)，使每次實(shí)驗(yàn)都具有較強(qiáng)的代表性，是一種高效、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)方法[17]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用正交表對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)、綜合比較、統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)現(xiàn)通過少數(shù)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到較好的治療方案，以達(dá)到最佳的治療效果。

MBP有中樞性MBP和周圍性MBP兩種，腦白質(zhì)中含量最高，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由少突膠質(zhì)細(xì)胞合成，是一種堿性的、不含糖和脂質(zhì)的膜蛋白。神經(jīng)纖維必須經(jīng)過髓鞘化才能發(fā)揮傳導(dǎo)功能，而MBP是參與髓鞘合成的一種非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在神經(jīng)纖維中起絕緣和快速傳導(dǎo)作用，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)功能的發(fā)揮扮演著重要的角色。人和鼠MBP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稍有不同，鼠腦中至少有21.5 kD、18.5 kD、17 a、17 b和14 kD 5種產(chǎn)物，而人有21.5 kD、20.2 kD、18.5 kD和17.3 kD 4種，其中18.5 kD MBP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘成熟期的主要蛋白。正常情況腦脊液中MBP含量小于6.95 mg/L，缺血性腦損傷發(fā)生時(shí)由于腦組織缺血缺氧導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡，髓鞘脫失，使MBP流向腦脊液中，再加上腦損傷本身導(dǎo)致血腦屏障的破壞，使漏入腦脊液中的MBP進(jìn)入血液，因此，血清MBP的測(cè)定能夠在一定程度上反映是否發(fā)生腦組織損傷，成為判定有無(wú)髓鞘脫失的一種特異性蛋白標(biāo)記物[18-20]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷早期MBP mRNA及蛋白表達(dá)都降低，尤其在腦缺血損傷的前24 h，MBP蛋白降低顯著[21]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[4, 22-23]，MBP對(duì)于預(yù)測(cè)腦損傷程度、判斷預(yù)后等方面都具有顯著作用。因此，本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了MBP mRNA及蛋白的表達(dá)，以確定腦損傷程度。MBP表達(dá)增加能起到腦保護(hù)作用[24]。本實(shí)驗(yàn)顯示，腦缺血損傷后MBP mRNA及蛋白的表達(dá)顯著降低，固綠染色表明髓鞘纖維同步減少，損傷的陽(yáng)性細(xì)胞顯著升高，因此證實(shí)，從各個(gè)水平檢驗(yàn)MBP都可作為檢測(cè)腦損傷，以及髓鞘損傷的生物學(xué)指標(biāo)。

傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢(shì)已得到證實(shí)[25]，胡黃連具有清熱燥濕、消痞退蒸、涼血利膽等作用[26]，且胡黃連苷Ⅱ是其有效成分之一。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅱ有較強(qiáng)的抗氧化作用[27]，能減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率[28]。前期我們也做了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胡黃連苷Ⅱ能夠抑制炎癥細(xì)胞因子Toll樣受體4、核因子κB、caspase-3以及腫瘤壞死因子α等的表達(dá)，抑制大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注后缺血半影區(qū)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制缺血損傷導(dǎo)致的腦細(xì)胞凋亡[29-33]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡黃連苷Ⅱ治療組較模型組，髓鞘排列有序，空泡細(xì)胞減少，MBP蛋白表達(dá)以及mRNA反轉(zhuǎn)錄水平都有不同程度的升高，從不同的水平證明了胡黃連苷Ⅱ的抗腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步的時(shí)間劑量?jī)?yōu)化表明，在缺血1.5～2.0 h給予胡黃連苷Ⅱ10～20 mg/kg，抗腦損傷作用顯著。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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