血栓素A2受體通過介導環氧酶2的合成增強類風濕關節炎滑膜細胞的增殖作用*

儲永良, 黃清春, 黃閏月, 晏靖遙， 陳秀敏， 徐偵雄

(廣東省中醫院, 廣州中醫藥大學第二附屬醫院風濕科, 廣東 廣州 510006)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA) 所致的關節滑膜細胞過度增殖，從而導致軟骨、骨和韌帶等結構的破壞，是重要的病理生理過程[1]。在治療方面，包括環氧酶2抑制劑(cyclooxygenase-2 inhibitors, COXIBs)在內的非甾體抗炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)如賽來昔布是RA治療的一線藥物，與改善RA病情藥(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)聯用可有效控制關節炎癥，減輕疼痛，改善病情。但是NSAIDs的長期應用存在誘發心血管事件的潛在風險，導致治療并發心血管疾病的RA患者時的藥物選擇困境[2]。近年來，靶向COX-2下游通路的研究逐漸開展，作為COX-2下游的主要產物之一，血栓素A2(thrombo-xane A2,TXA2)在腫瘤細胞、內皮細胞、部分炎癥細胞等眾多細胞類型中都被廣泛證實可以通過與其功能受體(TXA2R)相結合，進而激活多種細胞內信號轉導通路促進細胞的增殖、遷移與侵襲等生物學行為[3-4]。TXA2R屬于G蛋白偶聯受體，該類受體是RA治療的重要靶點[5]，有望通過此靶點找到臨床療效顯著而最小副作用的消炎鎮痛藥物。

材 料 和 方 法

1 材料

RA關節滑膜細胞株MH7A購自RIKEN生物資源中心(http://www.brc.riken.jp/lab/cell/english/)。MH7A是由RA患者的滑膜成纖維細胞經SV40T抗原基因轉染后轉化而成的永生化細胞株[6]。COX-2 siRNA 購自OriGene；TXA2R激動劑U46619和拮抗劑SQ29548均購自Cayman Chemical； MTS試劑盒與cDNA逆轉錄試劑盒均為Promega，而BrdU細胞增殖檢測ELISA試劑盒則購自Roche Applied Science；TRIzol試劑購自Invitrogen； SYBR Green Real-Time PCR 試劑盒購自Bio-Rad，相對應的real-time PCR檢測儀為Bio-Rad新一代的 CFX96 TouchTMDeep Well Real-Time PCR 檢測系統。

用于細胞培養的試劑：胎牛血清、雙抗(1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)和DMEM培養基均為Gibco生產；用于細胞消化傳代的胰蛋白酶(含EDTA)購自HyClone；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)為R&D Systems產品。

2 方法

2.1MH7A細胞的培養 MH7A細胞株培養于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液中。每2～3 d 更換新鮮培養基，一般經過3 d 時間細胞在培養皿中可達到90%覆蓋，此時用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，按1∶3傳代。

2.2加藥干預 MH7A細胞以每孔2×106加入多個6孔板, 并加入20 μg/L TNF-α刺激細胞以模擬RA患者關節滑膜組織微環境。細胞種板后置37 ℃、5% CO2培養箱中，經24 h待細胞貼板后, 設置空白對照組、U46619不同劑量組和SQ29548不同劑量組，分別給予不同濃度相應藥物進行干預。每24 h換液、換藥1次，培養條件同前。每組設3個復孔，各實驗重復不少于3次。

2.3mRNA提取、RNA逆轉錄和real-time PCR 收集藥物干預后的細胞，按TRIzol試劑說明書，提取和純化各樣本的mRNA。以A260/A280比值接近2.0作為純化標準。T7-Oligo(dT)作為引物使mRNA逆轉錄合成cDNA的第1鏈，RNase H介導cDNA第2鏈的合成，操作按照Promega公司逆轉錄試劑盒說明書。cDNA作為real-time PCR擴增產物的模板，β-actin作為看家基因。按照SYBR Green Real-Time PCR 試劑盒說明書構建反應體系，在定量PCR用96孔板中加入 SuperMix、cDNA和引物，用去RNase水配平每孔，然后上機運作CFX96 TouchTMDeep Well Real-Time PCR 檢測系統。數據按照2-ΔΔCT方法處理。

所用引物：人COX-2上游引物5’-TTCCTCCTGTGCCTGATG-3’，下游引物5’-CTGATGCGTGAAGTGCTG-3’；人β-actin上游引物5’-GGAAATCGTGCGTGACATT-3’，下游引物5’-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3’。反應條件： 95 ℃ 10 min起始模板變性，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。

2.4siRNA轉染 細胞接種于6孔板，用不含雙抗的培養基培養。用20 μg/L TNF-α預處理24 h后，按照Origene轉染試劑盒說明書操作，將2 μg non-target siRNA(control siRNA)和COX-2 siRNA分別轉入細胞，18 h后更換不含雙抗的新鮮培養基并繼續TNF-α刺激，此時可進行藥物處理等后續實驗。

2.5MTS與BrdU細胞增殖檢測 按照試劑盒說明書操作。酶標儀讀值，MTS檢測在492 nm波長下讀取活細胞數，而BrdU檢測則以595 nm 為參照在450 nm波長下讀值。實驗重復至少3次后取各組均數，細胞增殖率(%)=實驗組平均數/空白對照組平均數×100%。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示, SPSS 16.0軟件處理。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較則采用單因素方差分析的Dunnett’s檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TXA2R拮抗劑可有效抑制RA滑膜細胞的增殖

MTS實驗證實，特異性TXA2R拮抗劑SQ29548可有效抑制MH7A細胞的增殖，并且隨著劑量的加大和時間的延長，其抑制效應越明顯，見圖1A。在最小濃度0.1 μmol/L時，SQ29548處理MH7A細胞72 h后，與對照組比較其抑制效率達到(47.1±8.9)%，差異顯著(P<0.05)。而5 μmol/L SQ29548處理MH7A細胞24 h后，細胞增殖抑制率的差異達到統計學意義(57.8%±5.3%，P<0.05)，處理48 h后為(36.4±5.5)%(P<0.01)，處理72 h 后為(24.8±5.1)%(P<0.01)。因為5 μmol/L SQ29548在多種體外細胞株中均被證實可有效引起細胞生物學行為改變[3]，因此5 μmol/L作為最適SQ29548藥物濃度被應用于后續實驗。

2 TXA2R激動劑具有增強RA滑膜細胞增殖的作用

如圖1B所示，TXA2R激動劑U46619在0.1 μmol/L和5 μmol/L范圍內可有效增強MH7A細胞的增殖能力，且呈時間依賴性。5 μmol/L U46619處理MH7A細胞24 h后，細胞增殖能力明顯增強，細胞增殖率與對照組比較達(145.8±10.4)%，有顯著差異(P<0.05)。處理48 h后，細胞增殖率達(188.6±8.2)%(P<0.01)，72 h后高達(243.6±7.6)%(P<0.01)。

Figure 1. The effects of TXA2R antagonist SQ29548 (A) and agonist U46619 (B) on the MH7A cell proliferation.Mean±SD.n=4.*P<0.05, **P<0.01 vs control (0 μmol/L).

3 TXA2R抑制劑和激動劑對COX-2 mRNA的表達影響

分別用5 μmol/L的SQ29548和U46619處理MH7A細胞24 h后，收集細胞，提取總RNA，逆轉錄成cDNA后行SYRB Green real-time PCR檢測。如圖2所示，SQ29548可有效抑制COX-2 mRNA表達，COX-2 mRNA的表達量是對照組的0.42倍(P<0.01)。相反的，U46619顯著上調了COX-2 mRNA的表達，與對照組比較，COX-2 mRNA的表達量達2.21倍(P<0.01)。結果說明TXA2R抑制劑和激動劑可顯著干預COX-2 mRNA表達，提示在RA關節滑膜細胞中TXA2R可一定程度上控制COX-2的表達。

Figure 2. The effects of TXA2R antagonist and agonist on COX-2 mRNA expression.Mean±SD.n=4.**P<0.01 vs control.

4 在COX-2沉默的情況下，U46619可一定程度上重建受損的細胞增殖力

圖3A表明COX-2 siRNA轉染MH7A細胞后可有效抑制COX-2 mRNA的表達。在control siRNA轉染組中，1 μmol/L的U46619刺激48 h后對細胞增殖力的影響與MTS實驗結果一致，見圖3B、1B。如圖3B顯示，COX-2 siRNA轉染72 h后，細胞增殖率為(38.0±10.6)% (P<0.01)，與對照組相比，顯著降低。但用U46619刺激后細胞增殖能力顯著恢復，甚至接近對照組水平。這些結果表明，作為COX-2的下游產物，TXA2通過TXA2R介導了COX-2在RA滑膜細胞中的的細胞增殖效應。

討 論

在機體中COX-2是一種誘導性酶，主要在炎癥部位釋放。目前，COXIBs聯合DMARDs已經在RA臨床治療中被廣泛應用，而且DMARDs也被證實部分地通過抑制COX-2的活性來發揮抗炎作用的[7]。但COXIBs 由于不能有效抑制內皮細胞源性的TXA2，從而增加了心血管事件的發生率。這種安全隱患導致了Rofecoxib從藥物市場的撤離，也引起風濕病與鎮痛領域的研究者關注 COX-2下游產物[8]。

在RA關節腔微環境中，滑膜細胞和核微血管中的血小板在炎癥因子的刺激下均可產生TXA2[9]。早期的臨床研究就從關節滑膜組織和尿液檢測中發現，相較于正常組織和健康志愿者，RA患者表達更高水平的TXA2[10-11]。而最近一項對54個RA患者和20例健康對照組的臨床研究表明，在RA患者尿液中檢測出的TXA2代謝產物是健康志愿者的近2倍，并且不受生物制劑如TNF-α阻斷劑的影響[12]。這也許可以部分地解釋單用生物制劑并不能達到傳統DMARDs長期療效的現象。

Figure 3. TXA2R agonist recovered cell proliferative ability impaired by COX-2 siRNA.A: COX-2 siRNA significantly suppressed COX-2 mRNA expression; B: BrdU cell proliferation assay.Mean±SD.n=4.*P<0.05, **P<0.01 vs control siRNA alone; ##P<0.01 vs COX-2 siRNA alone.

本研究發現，TXA2R拮抗劑SQ29548可以時間和劑量依賴性地抑制TNF-α刺激條件下滑膜細胞的生長。相反的，TXA2R激動劑U46619則進一步促進滑膜細胞的增殖能力。這些結果充分說明TXA2在RA滑膜腫瘤樣增生病理中可通過其受體發揮正調節作用。當劑量達到10 μmol/L時，U46619促細胞增殖的效應反而下降，可能是因為激動劑與受體的結合已經達到飽和。U46619本身是一種TXA2的模擬物，通過與TXA2R的競爭性結合來發揮作用，因此當達到最大結合率時，藥效達到頂峰，更大劑量的U46619并不能發揮更多的作用，反而可能會引起未知的額外效應，有待進一步研究闡明。我們最近在腫瘤細胞體外模型中發現TXA2R可以通過一條從細胞膜與核內外的自我激活途徑控制COX-2的表達并持續刺激細胞增殖，并且在COX-2下游產物中，TXA2是COX-2促細胞增殖效應的關鍵傳遞者[3]。滑膜細胞腫瘤樣的病理特征提示我們有必要驗證TXA2R自我激活途徑在RA體外模型中的有效性。我們的結果表明，TXA2或者說TXA2R在RA滑膜細胞中也可以控制COX-2的表達。當用siRNA方法沉默COX-2后，RA滑膜細胞的增殖衰減支持了現有COXIBs在RA中的應用。重要的是，U46619幾乎可以重建受損的細胞增殖力，也就是說TXA2的功能補充可以恢復因COX-2受抑制而衰減的細胞增殖能力，明確說明TXA2及其受體就是COX-2在RA滑膜細胞中的關鍵效應傳遞者。

綜合分析，我們的研究結果支持TXA2在RA發病機制中的重要作用。而且，我們還在RA滑膜細胞中驗證了TXA2的功能自我調節機制，即TXA2通過其特異性受體TXA2R既可以控制其上游關鍵酶COX-2的產生，實現TXA2生成的正反饋調節，又可以有效傳遞COX-2的病理學效應，促進滑膜細胞的異常增殖。我們的研究說明，靶向TXA2及其受體有望發現新的RA治療藥物，進一步改善現有的治療方案。

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