連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)hUC-MSCs上NLR家族mRNA表達(dá)的影響*

陳智聰， 劉 俊， 廖繼東△， 谷景義， 楊曉蕾， 李揚(yáng)秋

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1田家炳醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 2血液病研究所，廣東 廣州 510632)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)來源于中胚層，存在于包括胚胎組織等多種成體組織內(nèi)，具有多向分化和自我更新能力，可對(duì)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活、增殖以及功能產(chǎn)生影響；它在創(chuàng)傷修復(fù)、組織功能重建、免疫治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)是天然免疫受體超家族中重要一員，可識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答和誘發(fā)調(diào)節(jié)獲得性免疫[3-5]。報(bào)道顯示某些NLR家族成員與MSCs分化和免疫調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)[6-7]。無論何種來源的MSCs，其初始細(xì)胞數(shù)量均無法滿足實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用，需要在體外進(jìn)行傳代擴(kuò)增。然而，細(xì)胞在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增后，其生物活性和功能必然隨之發(fā)生變化[8]。迄今，未見有關(guān)NLR家族全體成員在MSCs上表達(dá)及連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)其影響的報(bào)道。本研究采用RT-qPCR對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)連續(xù)培養(yǎng)傳代前后(第3和28代)的23個(gè)NLR家族成員的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量測定，探討傳代培養(yǎng)對(duì)hUC-MSCs上所有23個(gè)NLR家族成員mRNA表達(dá)的影響，為hUC-MSCs在連續(xù)培養(yǎng)傳代過程中增殖、遷移、分化、參與組織修復(fù)以及免疫調(diào)節(jié)等能力的改變積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為改進(jìn)hUC-MSCs傳代培養(yǎng)質(zhì)量與提高h(yuǎn)UC-MSCs在實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中的數(shù)量及安全性尋找切入途徑。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

取暨南大學(xué)華僑醫(yī)院婦產(chǎn)科出生的健康新生兒臍帶，長度約8～10 cm，胎齡37～40周，供者無先天性疾病及梅毒、艾滋病、肝炎等傳染性疾病，產(chǎn)婦及家屬對(duì)臍帶用于實(shí)驗(yàn)研究均知情同意；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購自Cyagen；RNAsimple Total RNA Kit購自北京天根生化技術(shù)有限公司；2×Taq PCR MasterMix購自廣州美津生物技術(shù)有限公司；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購自東洋紡生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1hUC-MSCs的分離與培養(yǎng) 無菌收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，用膠原酶II消化結(jié)合貼壁選擇分離純化hUC-MSCs，胰酶消化傳代培養(yǎng)至28代。

2.2hUC-MSCs的生物學(xué)特性鑒定 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原及利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基進(jìn)行成骨、脂肪誘導(dǎo)檢測其分化能力。

2.3RT-qPCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，由Oligo 7.0設(shè)計(jì)，并用NCBI Primer-BLAST分析引物特異性，滿足要求之后由上海英維捷基貿(mào)易有限公司合成，所有引物均經(jīng)過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，Vector NTI比對(duì)分析驗(yàn)證證實(shí)合格，引物序列見表1。

表1 NLRs的PCR引物序列

2.4細(xì)胞總RNA提取、鑒定和cDNA合成 RNA提取方法按天根RNAsimple Total RNA Kit說明書操作；取2 μL RNA樣本用微量核酸定量儀(Thermo)檢測RNA純度以及濃度。cDNA合成按東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Kit操作指南進(jìn)行。提取的RNA樣品于65 ℃變性5 min后置于冰上冷卻8 min，構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，于PCR儀經(jīng)37 ℃ 15 min、98 ℃ 5 min完成cDNA的合成。產(chǎn)物保存于-20 ℃。

2.5PCR產(chǎn)物鑒定 根據(jù)美津生物2×Taq MasterMix配置PCR反應(yīng)體系，在PCR儀(東勝創(chuàng)新)上以94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)。收集產(chǎn)物，取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(2%)，觀察條帶大小與預(yù)期值是否一致，剩余產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用Vector NTI進(jìn)行比對(duì)分析。選取擴(kuò)增片段序列與目的基因靶序列一致的引物作為樣本分析用引物。

2.6RT-qPCR 根據(jù)東洋紡THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix配置PCR反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀(Bio-Rad PTC-200)上反應(yīng)(95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，61 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán))。觀察擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線和溶解曲線，用公式2-ΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算得出目的基因相對(duì)于管家基因GAPDH的量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用Levene’s方差齊性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 hUC-MSCs的形態(tài)及生長特性

經(jīng)膠原酶消化分離的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種24 h后貼壁。原代培養(yǎng)細(xì)胞除梭形MSCs以外還含有形狀不規(guī)則的雜質(zhì)細(xì)胞，見圖1A；傳代培養(yǎng)細(xì)胞至第3代時(shí)，細(xì)胞純度較高，呈梭形聚集狀生長，一般3～5 d便可達(dá)80%～90%融合，見圖1B；傳代培養(yǎng)至23代，細(xì)胞增殖能力有所下降，但仍保持了良好的細(xì)胞形態(tài)，見圖1C；第28代后，細(xì)胞生長速度減緩、部分細(xì)胞呈平鋪狀、胞體變大、胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象，見圖1D。

2 hUC-MSCs的細(xì)胞表型

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示體外培養(yǎng)第3代和第28代hUC-MSCs的細(xì)胞表型均為：CD29+/CD44+/CD105+/CD31-/CD34-/ CD40-/CD45-/CD106-/HLA-DR-，見圖2。

Figure 1. Morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different passages (×100). A: primary cells; B: passage 3; C: passage 23; D: passage 28.

3 hUC-MSCs的分化能力

第3和28代hUC-MSCs被成骨誘導(dǎo)分化后，經(jīng)茜素紅染色，可以見到大量紅色鈣化基質(zhì)(圖3A、B)；兩代細(xì)胞被脂肪誘導(dǎo)分化后，經(jīng)油紅O染色，可以見到細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴(圖3C、D)，表明第3和28代hUC-MSCs均具有向成骨和脂肪分化的潛能，但第28代的分化能力較第3代弱，在脂肪誘導(dǎo)分化過程中表現(xiàn)尤為明顯。

4 RT-PCR產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果

如圖4所示，NOD1、NOD2、NLRC3、NLRC4、NLRC5、NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP4、NLRP5、NLRP6、NLRP7、NLRP8、NLRP9、NLRP10、NLRP11、NLRP12、NLRP13、NLRP14、CIITA、NAIP、NLRX1和APAF1目的條帶單一、清晰且與預(yù)期值相符。

5 第3和28代 hUC-MSCs的NLRs mRNA表達(dá)量比較

如圖5所示，23個(gè)NLR家族成員在連續(xù)培養(yǎng)傳代前后的hUC-MSCs中均有表達(dá)，其中NOD1、NLRC4、NLRC5、NLRP1、NLRP3、NLRP10、NAIP、NLRX1和APAF1 mRNA高表達(dá)，其余成員低表達(dá)， NLRP6和CIITA的表達(dá)尤為低下。hUC-MSCs經(jīng)長期培養(yǎng)至第28代，除NLRP10 mRNA表達(dá)上升和NLRC5、NLRX1 mRNA表達(dá)量基本保持不變外，其余成員的表達(dá)均有所下降，其中NLRP1 mRNA表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

MSCs來自于中胚層，存在于包括胚胎組織等多種成體組織內(nèi)，具有來源廣泛、取材容易、分離純化程序簡單、可在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增和保存等優(yōu)點(diǎn)，已成為替代治療和基因治療領(lǐng)域中極具應(yīng)用前景的干細(xì)胞。因此，研究MSCs的增殖、遷移、分化、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)功能具有十分重要的意義。研究顯示，天然免疫識(shí)別受體NLR家族部分成員與MSCs的功能有密切聯(lián)系[6-7]。

Figure 2. The flow cytometry results of cell surface markers on human umbilical cord mesenchymal stem cells at passage 3 (A) and passage 28 (B).

Kim等[6]證實(shí)hUCB-MSCs表達(dá)NLRs家族成員的NOD1和NOD2，且二者與MSCs成骨、脂肪分化和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)介導(dǎo)的磷酸化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，23個(gè)NLR家族成員在連續(xù)培養(yǎng)傳代前后的hUC-MSCs中均有表達(dá)，其中NLRP1的 mRNA在連續(xù)培養(yǎng)傳代前后的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。長期連續(xù)傳代培養(yǎng)后hUC-MSCs的成骨和脂肪分化能力降低與NOD1和NOD2的改變是否存在相關(guān)性有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。已知，NLRC5通過阻止NF-κB和IFN-I信號(hào)通路中IKKα和IKKβ的磷酸化而起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[9]；NLRX1位于線粒體基質(zhì)中，參與針對(duì)細(xì)菌/病毒入侵的活性氧生成反應(yīng)[10-11]。NLRP10屬于抗炎家族，參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)的精細(xì)調(diào)控[12-13]。hUC-MSCs經(jīng)長期培養(yǎng)后，其NLRC5和NLRX1表達(dá)基本不變，NLRP10的表達(dá)上升，這是否意味著長期培養(yǎng)后，hUC-MSCs對(duì)免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)控和識(shí)別細(xì)菌/病毒入侵的能力保持不變，而抗炎能力加強(qiáng)，應(yīng)在臨床移植治療中對(duì)此更進(jìn)一步的研究。CIITA主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞，B、T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[14]，是MHC-II表達(dá)所需的重要轉(zhuǎn)錄因子[15]，Tse等[16]證實(shí)人MSCs不表達(dá)MHC-II，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs表達(dá)的 CIITA mRNA極低，可能是其不表達(dá)MHC-II的誘因之一。NLRP12主要表達(dá)于骨髓來源的細(xì)胞，對(duì)TLR介導(dǎo)的NF-κB活化具有負(fù)性調(diào)控作用[17]。連續(xù)傳代培養(yǎng)前后(第3和28代)，hUC-MSCs的NLRP12 mRNA表達(dá)量降低，是否意味著TLR介導(dǎo)的NF-κB活化程度、細(xì)胞對(duì)外界病原體的感知能力和炎癥反應(yīng)發(fā)生的可能性會(huì)隨著hUC-MSCs的傳代培養(yǎng)逐漸升高，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Figure 3. Osteogenic (A, B; alizarin red staining, ×100) and adipogenic (C, D; oil red O staining, ×100) differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at the 3rd (A, C) and 28th (B, D) passages.

Figure 4. The agarose gel electrophoretogram of PCR products of NLRs. 1～23：NOD1, NOD2, NLRC3, NLRC4, NLRC5, NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRP4, NLRP5, NLRP6, NLRP7, NLRP8, NLRP9, NLRP10, NLRP11, NLRP12, NLRP13, NLRP14, CIITA, NAIP, NLRX1 and APAF1, respectively; M: marker.

綜上所述，hUC-MSCs表達(dá)NLR家族所有成員的基因，不同成員之間的基因表達(dá)量存在較大差異。在培養(yǎng)傳代過程中，hUC-MSCs大多數(shù)NLR家族成員的基因表達(dá)呈下降趨勢，部分基因表達(dá)水平增加或無變化，提示體外連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)hUC-MSCs表達(dá)NLR家族成員的影響是多向性的。因NLR家族不同成員及其信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖分化、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)功能等作用機(jī)制密切相關(guān)，可能反映長期培養(yǎng)對(duì)hUC-MSCs相關(guān)功能的影響，從而為hUC-MSCs的功能干預(yù)提供研究的靶標(biāo)，為改善培養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量，強(qiáng)化細(xì)胞功能指示方向。這些都必將有利于hUC-MSCs在組織工程和臨床移植治療中的應(yīng)用。

Figure 5. The mRNA expression of NLRs in passage 3 and passage 28 human umbilical cord mesenchymal stem cells. 1～23: NOD1, NLRC4, NLRC5, NLRP1, NLRP3, NLRP10, NAIP, NLRX1, APAF1, NOD2, NLRC3, NLRP2, NLRP4, NLRP5, NLRP6, NLRP7, NLRP8, NLRP9, NLRP11, NLRP12, NLRP13, NLRP14 and CIITA, respectively.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs passage 3.

[參 考 文 獻(xiàn)]

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