阮 萍， 肖 健， 楊 春， 蘇建家， 歐 超， 曹 驥， 駱成漂， 唐艷萍， 秦 虹,2， 孫 雯,2， 李 瑗△

(1廣西腫瘤醫院實驗研究部，廣西 南寧 530021； 2廣西醫科大學研究生院，廣西 南寧 530021；3廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院病理科， 廣西 南寧 530011； 4廣西中醫藥大學基礎醫學院，廣西 南寧 530001)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球面臨的重大公共衛生問題，是引起急慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病因。據世界衛生組織估計，全球現有慢性HBV感染者2.4億；全世界每年約有60萬患者死于HBV感染相關的肝硬化及肝癌[1]?？莘窦毎?Kupffer cells)是定居于肝臟的巨噬細胞，可監視肝臟環境，并可能通過其胞漿、胞膜受體激活并介導吞噬病毒以及通過參與調節適應性免疫等方式，在控制HBV復制及抗病毒方面起重要作用[2]。

樹鼩與人類親緣關系密切，已逐漸被認識到是一種新型的有巨大開發潛力的實驗動物。以往的研究表明不僅樹鼩的原代肝細胞能體外感染HBV，同時樹鼩體內也能感染HBV[3]。本課題組近年來關于新生樹鼩感染HBV的研究表明，新生期接種HBV的樹鼩能夠長期感染HBV，并且HBV能夠在樹鼩體內穩定復制和長期存在[4]。本研究在課題組以往研究的基礎上，通過對慢性感染HBV樹鼩肝組織進行枯否細胞數量及功能的檢測，以探索枯否細胞在樹鼩感染HBV慢性化過程中的可能作用。

材 料 和 方 法

1 動物

繁殖用的野生成年樹鼩購自中國科學院昆明動物研究所；本課題所用樹鼩為以上動物在本實驗室經人工繁育的后代。動物飼養環境和方法見以往報道[5]。

參照臨床上慢性HBV感染者的診斷標準[6]，本研究對自然壽命6～8年的樹鼩設定的慢性感染標準為血清乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)陽性、血清和(或)肝組織HBV DNA陽性超過24周；而“疑似慢性感染”則指動物在接種后48周或更長的期間，上述標志物2次以上顯示陽性，并且此期間血清乙型肝炎病毒表面抗體(hepatitis B virus surface antibody，HBsAb)為持續陰性或僅在接種后早期偶為陽性。根據感染情況將樹鼩分為3組：A組(n=6):為已確認慢性感染HBV的樹鼩(感染時間為89～324周)；B組(n=6):為疑似慢性感染HBV的樹鼩(感染時間為171～229周)；C組(n=4):正常對照樹鼩，即從未接種HBV，血清HBsAg、HBsAb及HBV DNA皆為陰性。

2 主要試劑

DMEM培養基及胎牛血清為HyClone產品；Percoll液、牛胰島素及肝素鈉為Sigma產品；β-巰基乙醇為Amresco產品；膠原酶Ⅳ及熒光定量PCR試劑盒為Life Technologies產品；鼠抗人CD163和兔抗人溶菌酶(lysozyme)多克隆抗體、PV9000兩步法免疫組化檢測試劑盒及濃縮型DAB染色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術公司產品；熒光素PE標記抗CD163抗體和熒光素PE標記鼠IgG為eBioscience產品；印度墨汁為國藥集團化學試劑有限公司產品；溶酶體紅色熒光探針為上海碧云天生物技術有限公司產品；RNA提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產品；其它常用試劑均為國產分析純試劑。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司根據www.ncbi.nlm.gov數據庫中國樹鼩GAPDH及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)mRNA序列設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

3 主要方法

3.1標本收集 定期對樹鼩行剖腹取肝組織活檢手術，每6～12月1次。肝活檢組織一部分經10%中性甲醛固定和石蠟包埋后作免疫組織化學檢查，另一部分用以分離枯否細胞。

3.2樹鼩枯否細胞分離、純化及培養 在切取的肝組織塊邊緣處剪2～3個小切口，用裝滿D-Hanks液的注射器插入血管斷端內緩慢沖洗，隨后注入事先在37 ℃預熱的含0.1%膠原酶IV的消化緩沖液對肝組織進行消化，至肝組織變軟、輪廓塌陷；剪碎未徹底消化的肝組織至呈糊狀；所有肝組織消化物37 ℃水浴振蕩1.5 h；過200目細胞篩，即得到肝細胞懸液；肝細胞懸液用差速離心法分離肝非實質細胞；用30%/70% Percoll液梯度密度離心法進一步分離出以枯否細胞為主的肝非實質細胞(該處分離的肝非實質細胞用于流式細胞術檢測)；沉淀的細胞用枯否細胞培養液(10% 胎牛血清10 mL、1% 青-鏈霉素復合液、1 mmol/L β羥基乙醇和0.001% 胰島素)重懸，然后分別接種于培養瓶或鋪好蓋玻片的六孔板內；培養30 min后用DMEM輕輕洗去未貼壁的細胞以純化枯否細胞；重新加入培養液，置37 ℃、5% CO2培養箱內培養12 h。臺盼藍染色判斷細胞活性；聯合應用墨汁吞噬實驗、CD163及溶菌酶免疫細胞化學染色和透射電鏡觀察等方法鑒定枯否細胞[7]。

3.3流式細胞術檢測 肝非實質細胞經Percoll梯度密度分離后，收集約1×106個細胞用流式細胞緩沖液重懸；加入熒光素PE標記抗CD163抗體，輕柔吹打混勻；取自正常對照組動物的枯否細胞懸液2管，分別加入熒光素PE標記鼠IgG或PBS，作為同型對照及空白對照；避光4 ℃孵育40 min；使用BD LSRll型流式細胞儀，PE通道電壓設置為350 V，收集1×105個細胞；首先上樣同型對照管，根據前向角散射(forward angle scatter，FSC)及側向角散射(side angle scatter，SSC)圈定待測細胞群，并在相應的熒光直方圖中調出陰性對照標本，劃定陰性與陽性細胞界標，使陰性細胞的假陽性率<1%，再以SSC/CD163-PE雙參數設門，檢測各管中CD163+細胞的光散射和熒光強度。

3.4免疫組織化學染色 切片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇至水化；按抗體說明書進行檸檬酸鹽高溫高壓修復；3%H2O2抑制內源性過氧化物酶；滴加適當濃度的I抗工作液，4 ℃冰箱孵育過夜；按試劑盒說明書的兩步法滴加II抗；滴加DAB顯色。對照設計：每批染色分別用I抗說明書建議的組織切片作為陽性對照；以非免疫正常小鼠血清代替I抗作為陰性對照；空白對照以PBS代替I抗。染CD163和溶菌酶的切片根據陽性細胞的數量進行評分，方法：每例切片分別隨機取10個高倍視野(×400)，計數其中的陽性細胞個數，取平均值[8]。以上所有染色結果的評判均采用統一標準和雙盲法，由2名研究者分別閱片、評分。

3.5枯否細胞溶酶體檢測 用細胞培養液配制溶酶體探針LysoTracker Red工作液，使其最終濃度為50 nmol/L，使用前用37 ℃水浴預溫；細胞培養12 h后，去除細胞培養液，加入LysoTracker Red染色工作液，37 ℃孵育60 min；去除LysoTracker Red染色工作液，加入新鮮的細胞培養液，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照；每個培養皿分別隨機觀察5個高倍視野(×400)，選擇手動曝光以保證每張照片的曝光時間相同；用Image-Pro Plus 6.0軟件進行陽性細胞計數及熒光強度分析，細胞平均熒光強度即平均吸光度=總吸光度/陽性細胞數，取5個高倍視野的平均值[9]。

3.6實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative RT-PCR，real-time RT-PCR)檢測枯否細胞TNF-α mRNA表達水平 細胞培養12 h后，加入消化酶消化并收集細胞；引物序列見表1。采用RNA提取試劑盒提取總mRNA；用蛋白核酸定量儀測定總RNA的濃度和純度，將樣品的總RNA濃度稀釋調整為1 g/L；參照RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒實驗操作說明，以Oligo(dT)18為引物進行逆轉錄；使用SYBR Select Master Mix熒光實時RT-PCR試劑盒，擴增反應在ABI 7300 System上進行，反應條件：95 ℃ 15 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，40個循環；用7300 System SDS Software 1.2.3分別構建TNF-α和GAPDH的標準曲線，并設置標準品的梯度稀釋拷貝數；PCR擴增結束后，分析儀顯示標準曲線、擴增曲線和熔解曲線，每個樣本取3次獨立實驗數據的平均值；凝膠圖像分析系統(Gel-Pro Analyzer 3.0)分析目的基因與看家基因GAPDH條帶吸光度的比值。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示；組間比較采用非參數秩和檢驗(Mann-Whitney Test),以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肝臟非實質細胞中枯否細胞的比例及肝內枯否細胞計數

以FSC和SSC設門，在熒光直方圖上觀察到A、B、C 3組均可見2個獨立細胞亞群即P1及P2亞群，其中P1亞群細胞FSC值較大。已知枯否細胞在肝臟主要的非實質細胞中體積最大，直徑為12 μm[10]，故可確認P1亞群即為以枯否細胞為主的肝臟非實質細胞，而P2亞群可能為其它體積較小的肝臟非實質細胞。將P1亞群圈定，再用SSC通道結合PE熒光標記CD163通道設門，可見CD163+的細胞群(P)，見圖1。

CD163陽性染色定位于胞漿，呈顆粒狀棕黃色。A組的陽性細胞主要位于肝細胞壞死灶周圍，或聚集于匯管區炎癥灶內；B組和C組的CD163陽性細胞主要分布于匯管周的肝竇內。

結果顯示，A組CD163+細胞在分離的肝非實質細胞中所占比例及在肝組織內的數量均高于B組及C組(P<0.05)，而B組及C組間的差異無統計學意義，見圖1及表2。

Figure 1. Flow cytometry assay (upper) and immunohistochemical staining (×200; lower) of Kupffer cells in tree shrew livers. P1: the non-parenchymal liver cells, the majority of which were Kupffer cells; P2: the other non-parenchymal liver cells exclusive of Kupffer cells; P: CD163+ Kupffer cells. A: group A, identified as persistently infected with HBV; B: group B, suspected as persistently infected with HBV; C: group C, not inoculated with HBV.

表2 樹鼩肝內CD163標記枯否細胞的比例及數量

2 枯否細胞的溶酶體個數及溶菌酶表達

在倒置熒光顯微鏡下觀察到LysoTracker Red熒光探針標記的溶酶體顆粒位于枯否細胞的胞漿中。A組細胞溶酶體的熒光強度低于其余2組(均P<0.05)，而B組與C組之間的細胞溶酶體熒光強度差異無統計學意義。

免疫組化染色方法原位檢測樹鼩肝內枯否細胞溶菌酶的變化，光鏡下見溶菌酶陽性細胞主要分布于肝竇內，呈橢圓形、梭形、多角形或星形。陽性染色定位于胞漿，呈顆粒狀棕黃色。A組溶菌酶陽性細胞計數顯著少于B、C組(均P<0.05)，而B組與C組之間溶菌酶陽性細胞計數差異無統計學意義，見圖2及表3。

3 枯否細胞TNF-α mRNA表達水平

實時熒光定量RT-PCR檢測結果顯示A組樹鼩枯否細胞的TNF-α mRNA表達水平顯著低于B組和C組(均P<0.05)，而B、C組之間的差異無統計學意義,見圖3。

討 論

枯否細胞是肝固有免疫系統中的重要的一員，但其在HBV感染及病程慢性發展的過程中究竟扮演著怎樣的角色迄今尚不十分清楚。為此，本研究檢測了慢性感染HBV的樹鼩肝組織內枯否細胞數量及功能的變化，結果顯示持續感染HBV的A組動物肝組織中CD163陽性細胞(枯否細胞)的比例和數量均明顯高于其余兩組動物，這種現象與人類慢性感染HBV患者肝內枯否細胞的改變相類似[11]。提示慢性期特別是機體清除病毒失敗后，HBV大量復制，隨即啟動以適應性免疫應答為主的各種反應，所產生的炎性產物可通過激活枯否細胞導致慢性感染HBV的樹鼩肝組織內枯否細胞逐漸增多[12]。

枯否細胞作為大吞噬細胞，吞噬作用是其清除病原體的重要途徑。溶菌酶是枯否細胞溶酶體水解酶中重要的一員，可反映枯否細胞的吞噬及免疫能力[13]。乙型肝炎病毒感染后，由于肝臟清除及屏蔽功能的削弱，腸源性內毒素滅活不全，常導致不同程度的內毒素血癥。小劑量、短時間的內毒素作用可增強體外培養枯否細胞的吞噬作用，而劑量過大，時間過長反而抑制其吞噬功能[14]。本研究中A組動物的標記枯否細胞溶酶體探針的紅色熒光強度顯著低于B、C組，與溶菌酶的表達水平一致，表明在慢性感染HBV的A組樹鼩肝組織內，枯否細胞內的溶酶體數量及溶菌酶表達量均減少，即提示枯否細胞的吞噬功能下降。有趣的是，結合本研究關于免疫組化檢測肝組織內CD163+和溶菌酶表達情況的結果發現，A組CD163+細胞個數顯著高于B組和C組，但A組溶菌酶陽性細胞個數則顯著低于B組和C組；A組CD163+細胞個數遠高于溶菌酶陽性細胞個數，而B組和C2組的這2個指標的數值相差不遠。這一現象提示在慢性感染HBV的A組樹鼩中，大部分表達CD163+的枯否細胞不表達溶菌酶，即A組樹鼩肝組織內這些數量增加的枯否細胞的吞噬能力是下降的。由此推測在慢性感染HBV的個體中，代償性數量增加但功能下降的枯否細胞無法直接或協助適應性免疫系統清除入侵的病毒或被感染的肝細胞，從而導致HBV復制失控、病情遷延發展。

Figure 2. Lysosome count (LysoTracker Red staining; upper) and lysozyme expression (immunohistochemical staining; lower) in Kupffer cells in tree shrew livers (×200). A: group A, identified as persistently infected with HBV; B: group B, suspected as persistently infected with HBV; C: group C, not inoculated with HBV.

表3 樹鼩肝內枯否細胞溶酶體及溶菌酶數量

Figure 3. TNF-α mRNA expression in tree shrew Kupffer cells tested by real-time RT-PCR. Mean±SD. n=13. *P<0.05 vs other groups.

為評價樹鼩枯否細胞合成炎癥介質的能力，本研究還檢測了枯否細胞TNF-α mRNA的表達情況。有研究證實枯否細胞在TLR 1～9的配體刺激下產生炎性細胞因子TNF-α或IL-6。并且在TLR1、2、4及 6配體的刺激下能誘導T細胞增殖及IFN-γ的合成[15]。轉HBV基因小鼠體內實驗也證實肝內活化的枯否細胞可通過分泌IL-12及TNF-α，來誘導NK細胞及T淋巴細胞產生IFN-γ，從而抑制HBV的復制[16]。而HBV本身又可反過來影響TNF-α的合成[17]。本研究結果顯示，慢性感染HBV的A組樹鼩枯否細胞TNF-α mRNA的表達水平比B組和C組低，這一現象與前述的A組樹鼩枯否細胞吞噬功能下降一致，推測可能是持續、高載量的HBV導致該組動物肝組織中枯否細胞合成TNF-α減少，而TNF-α mRNA表達的下調則解除了枯否細胞對HBV復制的抑制作用，使該病毒能在肝細胞內大量復制[16]。

綜上所述，本研究發現在樹鼩慢性感染HBV過程中，枯否細胞的數量及在肝非實質細胞中的比例增加，但該細胞的吞噬功能及合成炎癥介質TNF-α等功能下降，這些變化使HBV得以逃避枯否細胞的免疫效應，從而引起病程慢性化。

[參 考 文 獻]

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