PI3K/Akt信號通路在膿毒癥腎臟損傷誘導的自噬中的調節作用*

向鏡芬， 楊 祥， 龔劍鋒， 雷偉健， 鄧艷瓊， 牟 丹， 鐘國權， 孟啟勇

(暨南大學第五附屬醫院，清遠市人民醫院重癥醫學科， 廣東 清遠 511500)

膿毒癥是由感染引發的全身性炎癥反應綜合征，是ICU患者發生急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)的常見原因[1]。AKI是預測膿毒癥患者死亡的獨立危險因素[2]。尋找介導膿毒癥AKI腎小管上皮細胞損傷的關鍵分子并闡明其調控機制，對于早期干預膿毒癥AKI具有重要的科學意義。近年來研究發現細菌內毒素及其炎癥因子是誘導腎臟損傷的直接且重要的原因。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激機體引發嚴重炎癥反應，常常產生大量致炎癥因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，從而導致氧化應激、線粒體損傷和能量耗竭，最終導致腎小管上皮細胞凋亡[3]。在此過程中，細胞自噬對于腎小管上皮損傷和修復可能發揮了重要的作用。

自噬是真核細胞處于缺氧、饑餓或感染時，在自噬相關基因的調控下，利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質，為細胞修復、更新提供原料與營養、保持能量穩態的過程，是有別于凋亡的另一種程序性死亡機制[4]，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路是影響細胞自噬重要的信號通路[5]。近年來有研究表明，自噬在膿毒癥的致病過程中發揮重要作用[6-8]。那么自噬是否參與了膿毒癥時腎小管上皮細胞的損傷機制？PI3K/beclin-1復合物的形成對膿毒血癥時腎小管上皮細胞的自噬是否至關重要？值得深入研究。本研究擬建立盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)模擬腹膜炎大鼠膿毒癥模型，觀察腎小管上皮細胞是否存在自噬現象。并且進一步進行體外實驗證實是否一定濃度的LPS可刺激腎小管上皮細胞發生自噬，探討PI3K/Akt信號通路是否通過形成復合物促進自噬對膿毒癥時腎小管上皮細胞的保護作用，為臨床干預膿毒癥AKI提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 材料

雄性SD大鼠，250～300 g，9只購自中山大學動物中心。HK-2細胞株購自ATCC。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Pierce。微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)抗體購自Sigma。p-Akt(308)抗體、p-Akt(472)抗體、Akt抗體、beclin-1抗體、GAPDH抗體和活化caspase-3 抗體均購自CST。多聚賴氨酸購自Sigma。DMEM/F12培養基和胎牛血清購于Gibco。二甲基亞砜購自Sigma。山羊抗兔Ⅱ抗為Jackson產品。其它所用生化試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1膿毒癥誘發急性腎損傷模型的構建 SD大鼠麻醉用 10%水合氯醛(生理鹽水配制)腹腔注射，劑量為4 mL/kg。在腹部中線打開腹腔(切口3～4 cm)，找到盲腸，仔細將盲腸間的腸系膜剪開(注意不要剪斷膜上的血管，以避免大出血)，在離盲腸4 cm處用5-0絲線結扎，18G針頭(10 mL注射器針頭)穿刺4次，在穿孔處輕輕擠出1 mm排泄物。6-0絲線兩層縫合傷口。腹腔注射(50 mL/kg皮下注射)預熱生理鹽水，籠中蘇醒。CLP 6 h后皮下注射廣譜抗生素(亞胺培南/西司他丁)14 mg/kg(10 mL預熱生理鹽水)。麻醉動物后6 h和24 h，采血、處死并摘取腎臟。

2.2腎損傷指標檢測

2.2.1組織切片糖原染色 各組處死后取右側腎臟一部分，將剩余部分的腎皮質置于液氮中凍存后轉至-70 ℃ 存放, 用于Western blotting檢測蛋白的表達。將腎臟置于甲醛溶液固定48 h，放入自動脫水機中進行固定，共設定 12 h，固定后再進行石蠟包埋，包埋后在切片機上進行切片，后將切片放入防脫載玻片上，置于4 ℃冰箱保存。PAS染色步驟如下：常規切片 2～3 μm，脫蠟至水，0.5%高碘酸氧化 6～8 min，蒸餾水洗，無色品紅加蓋避光7 min，不經水洗，擦凈組織旁多余染液，0.5%偏重亞硫酸鈉作用 1 min，水洗 2～5 min，Harris 蘇木素復染 1 min 左右，水洗，1%鹽酸乙醇分化。片刻，自來水反復沖洗，溫水反藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。置于普通光學顯微鏡下觀察腎間質及腎小管的變化并拍照。

2.2.2血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)及血清肌酐(serum creatinine， SCr)檢測 實驗結束小鼠腹腔麻醉后心臟取血, 一部分離心分離血清, 酶法測定BUN和Scr濃度[9]。所需試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

2.3Western blotting檢測信號蛋白的表達 CLP大鼠腎臟組織置于勻漿器中，冰上勻漿后，加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4 ℃、12 000 r/min 離心 40 min，取上清。以BSA為標準，用Bradford法對上清進行蛋白定量，取20～40 μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE，100 V轉移1 h至PVDF膜，放入封閉液中37 ℃ 1 h，Ⅰ抗4 ℃過夜；次日TBST洗膜5 min 3次，將膜與堿性磷酸酶標記的抗IgG抗體孵育，室溫搖床上輕搖1 h，TBST洗膜5 min 3次，曝光，用圖像分析測定各吸光度值作定量分析。

2.4HK-2細胞培養 HK-2細胞于10%胎牛血清+DMEM細胞培養液37 ℃、5%CO2條件下培養，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。將HK-2細胞以2×108/L接種于6孔板，待細胞生長至70%～80%融合時，用無血清無添加因子的Keratinocyte-SFM培養液培養24 h，使細胞生長同步化。然后將細胞置于無血清無添加因子的培養基中，分別用加入不同濃度的LPS(0、0.1、10和20 mg/L)培養12 h;而在另外一組加入10 mg/L LPS，然后培養不同時間(0～12 h)，收集細胞總蛋白，進行Western blotting檢測。

2.5Hoechst 33342和Annexin V/PI雙染定量和定性凋亡 將HK-2細胞以2×108/L接種于6孔板并分為4組：LPS刺激組、LPS+3-甲基腺嘌呤(3-me-thyladenine,3-MA)組、LPS+Akt inhibitor組和對照組(加PBS),抑制劑均購自Sigma。分組處理后，去除培養液，消化，離心，收集細胞，PBS洗2遍，加入5 μL Hoechst 33342染色液和5 μL PI染色液。混勻后，4 ℃孵育20～30 min，PBS洗1次，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。同上培養，收集細胞后，用4 ℃預冷的PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min；用250 μL結合緩沖液重懸細胞，取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中加入5 μL Annexin V和10 μL PI溶液，室溫避光染色10 min，加入300 μL PBS后用流式細胞儀檢測凋亡細胞、正常細胞、壞死細胞，對結果進行統計分析。同時，離心收集細胞進行Western blotting檢測LC3的表達。

3 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，進行方差分析和LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CLP大鼠腎臟發生明顯損傷

與假手術組比較，盲腸結扎穿刺動物普遍出現腎損傷，且隨著時間的推移，損傷程度加劇，出現腎小管上皮細胞膨脹，刷狀緣缺失，空泡變性，壞死，管型形成，細胞脫落等病理改變,見圖1A。與假手術組比較，CLP組動物在術后，隨著時間的推移，BUN和SCr均有上升,見圖1B、C。

Figure 1. The changes of kidney histopathology, blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) in CLP and control (sham) rats. A： HE staining (×40)； B: BUN; C: SCr. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs sham group.

2 CLP大鼠腎臟自噬相關蛋白LC3、beclin-1含量及Akt磷酸化水平的變化

Western blotting結果表明，對照組(0 h)LC3表達較低，CLP發生6 h后開始上調，12 h達到最高峰，18 h有所下降;Beclin-1表達趨勢與LC3相同，見圖2A,證明CLP腎臟損傷時有顯著的自噬發生。Wes-tern blotting顯示細胞活化caspase-3蛋白表達水平升高，并呈時間依賴性，說明CLP腎臟損傷誘導了caspase-3介導的細胞凋亡，呈時間依賴性,見圖2A。Western blotting結果表明，對照組p-Akt表達較低，CLP發生2 h后開始上調，6 h達到最高峰，12 h有所下降;Akt在CLP腎臟損傷后隨時間的推移無明顯變化，見圖2B。

Figure 2. The protein expression of LC3, beclin-1,activated caspase-3 and p-Akt in renal tissues at different time points after CLP detected by Western blotting. A: expression of LC3, beclin-1 and activeated caspase-3; B: expression of p-Akt(308) and p-Akt(472). Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 h.

3 體外細胞實驗檢測自噬相關蛋白LC3含量及Akt磷酸化水平

3.1不同濃度LPS刺激HK-2細胞后自噬相關蛋白的表達 Western blotting結果表明，體外不同濃度LPS刺激HK-2細胞后，對照組(未刺激組)p-Akt(308)表達水平較低，隨著刺激濃度的增加，p-Akt(308)表達水平逐漸提高；對照組(未刺激組)p-Akt(472)表達水平較低，0.1 mg/L LPS刺激后p-Akt(472)表達水平逐漸提高，10 mg/L LPS刺激組p-Akt(472)表達水平最高，20 mg/L LPS刺激組p-Akt(472)表達水平有所下降。LC3表達水平與p-Akt(472)表達變化趨勢一致，見圖3A。

3.2LPS刺激HK-2細胞后不同時點自噬相關蛋白的表達 Western blotting結果表明，對照組(未刺激組)p-Akt(308)表達水平較低，隨著刺激時間的延長，p-Akt(308)表達水平逐漸提高；對照組(未刺激組)p-Akt(472)表達水平較低，LPS 刺激4 h后p-Akt(472)表達水平逐漸提高，8 h p-Akt(472)表達水平最高，12 h p-Akt(472)表達水平有所下降。LC3表達水平與p-Akt(472)表達變化趨勢一致，見圖3B。

4 PI3K 信號通路抑制劑對LPS刺激HK-2細胞后自噬相關蛋白表達的影響

Western blotting分析表明，與LPS刺激組相比，抑制劑組(LPS+3-MA和LPS+Akt inhibitor組)LC3表達量顯著下調，見圖4A。Hoechst 33342和Annexin V/PI雙染進行細胞凋亡實驗，結果表明與LPS刺激組相比，抑制劑組(LPS+3-MA和LPS+Akt inhibitor組)HK-2細胞凋亡明顯增加(P<0.05)，見圖4B。

Figure 3. The protein expression of LC3 and p-Akt in HK-2 cells after LPS treatment at different time points and different concentrations. A: LPS treatment at 0, 0.1, 10 and 20 mg/L for 12 h; B: 10 mg/L LPS treatment at 0, 4, 8 and 12 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 mg/L or 0 h.

Figure 4. The levels of autophagy-related protein LC3 in HK-2 cells (A) and apoptosis of HK-2 cells (B) treated with LPS plus PI3K inhibitor or Akt inhibitor.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.01 vs LPS alone.

討 論

膿毒癥合并AKI患者死亡率明顯高于不伴AKI者，病死率超過70%[1]，成為危重病急救醫學面臨的急需解決的難題之一。研究發現，膿毒癥所致AKI的發生機制不同于經典的缺血再灌注引起的AKI[10]。過去認為膿毒癥合并AKI時的主要病理生理機制主要是腎小管管周微循環障礙導致腎臟低灌注，及腎臟缺血后引起的急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)。然而，膿毒癥AKI死亡患者腎臟病理顯示，70%患者并無ATN發生，而腎小管上皮細胞凋亡更為常見[11]。另一方面，膿毒癥動物模型腎臟血流動力學結果顯示，近2/3提示腎臟缺血，而1/3提示腎臟血流量保持不變或增加，后者更接近人體發生膿毒癥的高動力型膿毒休克狀態[11]。在腎臟血流量不變甚至增加的情況下，腎小管上皮細胞仍然發生凋亡，提示腎臟血流動力學改變僅僅是膿毒癥引起腎臟損傷的一部分原因。而細菌內毒素及其炎癥因子是誘導腎臟損傷的直接且重要的原因。以LPS為代表的內毒素，刺激機體引發嚴重炎癥反應，常常產生大量致炎癥因子如TNF-α和ROS，從而導致氧化應激、線粒體損傷和能量耗竭，最終導致腎小管上皮細胞凋亡。在此過程中，細胞自噬對于腎小管上皮損傷和修復可能發揮了重要的作用。

自噬是真核細胞處于缺氧、饑餓或感染時，在自噬相關基因的調控下，利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質，為細胞修復、更新提供原料與營養、保持能量穩態的過程，是有別于凋亡的另一種程序性死亡機制。凋亡的最終結局是細胞死亡，而自噬是細胞存活與死亡的一把“雙刃劍”[12]。同時兩者在一定程度上又密不可分：自噬為凋亡所需，自噬通常先于凋亡，進而啟動凋亡；適度的自噬抑制凋亡，保護細胞免于發生凋亡和壞死；自噬過度可以向凋亡轉化，共同促進細胞死亡[13]。目前關于自噬在腎小管上皮細胞中的研究多集中在缺血再灌注、藥物腎損傷和梗阻性腎病方面[14-16]。近年來有研究表明，自噬在膿毒癥的致病過程中發揮重要作用。膿毒癥患者肝臟組織及膿毒癥大鼠模型的心臟、肝臟中可觀察到自噬小體產生，同時伴有線體粒氧化損傷，證明膿毒癥時組織細胞有自噬現象[6-8]。此外，在CLP模擬腹膜炎及LPS腹腔注射這2種膿毒癥小鼠模型中都看到，敲除關鍵性自噬基因LC3及beclin-1后，炎癥因子IL-1β、IL-18等分泌明顯增加[17]，減少自噬將促進或加重炎癥反應并導致細胞死亡[18]，提示自噬在膿毒癥發病及炎癥反應中起到重要作用。PI3K/Akt是一條經典的存活信號通路，在細胞凋亡和腫瘤發生中發揮著重要作用。PI3K可以使其下游分子Akt磷酸化。近些年來，在許多研究中證明了PI3K/Akt信號通路可以通過下游分子mTOR來調節自噬。

我們建立了CLP模擬腹膜炎大鼠膿毒癥模型，觀察腎小管上皮細胞是否自噬現象。觀察到隨著時間的推移，腎臟損傷程度加劇，出現腎小管上皮細胞膨脹、刷狀緣缺失、空泡變性、壞死、管型形成、細胞脫落等病理改變，同時BUN和SCr均有上升，提示CLP模擬腹膜炎大鼠膿毒血癥造成腎臟損傷的模型構建成功。為了檢測CLP腎臟損傷時腎小管上皮細胞是否發生自噬，我們采用Western blotting檢測了自噬相關分子的表達，結果表明腎臟損傷自噬相關蛋白LC3、beclin-1含量及Akt磷酸化水平均隨著CLP腎臟損傷發生時間的推移表達上升。我們發現CLP后beclin-1 表達于6 h開始上調，12 h達最高峰，有趣的是beclin-1 表達量在18 h有所下調，可能由于長時間內毒素刺激誘導腎小管上皮細胞大量凋亡，caspase-3過度活化，而活化的 caspase-3具有剪切 beclin-1 的作用[18]，從而導致beclin-1 表達下降。我們進一步在體外實驗證實了一定濃度的LPS可刺激腎小管上皮細胞發生自噬。不同濃度的LPS以及不同刺激時間均可促使HK-2細胞的自噬相關蛋白LC3及p-Akt表達量上升。同時，使用PI3K及Akt抑制劑后自噬相關蛋白的表達量有所下降，同時HK-2細胞凋亡明顯增加，提示PI3K/Akt信號通路可能對CLP腎臟損傷誘導的自噬有調節作用。

本研究通過建立經典的膿毒癥AKI大鼠模型(CLP模型)和LPS細胞模型，明確膿毒癥時腎小管上皮細胞是否發生自噬；采用公認的自噬抑制劑3-MA和PI3K抑制劑觀察它們對膿毒癥腎小管上皮細胞損傷的影響，探討beclin-1及Akt是否通過通過促進自噬對膿毒癥腎小管上皮細胞的保護作用。本研究有助于揭示膿毒癥時腎小管上皮細胞損傷的新機制，為臨床干預膿毒癥AKI提供新的策略。

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