激活PPARα表達對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大及 NFATc4與p65-NFκB相互作用的影響*

鄒 劍， 周后鳳， 先志偉， 劉培慶

(1成都市第五人民醫院藥劑科，四川 成都 611130; 2中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東 廣州 510006)

左心室肥厚是原發性高血壓最常見的器官損傷性疾病，是心臟對壓力負荷和神經體液因素改變的代償性反應。心肌肥厚不僅僅是心力衰竭前期的一種適應性反應，也是心肌缺血、心律失常和猝死等心血管疾病的獨立危險因素[1]。導致病理性心肌肥厚的主要因素包括基因多態性、高血壓、缺血性損傷導致的心肌細胞死亡、心肌代謝改變等[2]。心肌肥厚和心力衰竭是眾多心血管疾病的嚴重和終末階段，研究其信號轉導機制具有非常重要的意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體 α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)激動劑非諾貝特(fenofibrate)可通過多種信號途徑調控心肌肥大[3-4]。我們近期研究發現激活PPARα后可促進心肌細胞核內PPARα與活化T細胞核因子胞漿型4(nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 4, NFATc4)之間的相互結合，抑制NFATc4與GATA 4之間的相互作用，進而抑制NFATc4在肥大基因腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)啟動子上的DNA結合活性，而沉默PPARα后可取消上述效應[5]。鈣調磷酸酶/NFATc4信號通路是調控心肌肥大的關鍵環節[6]。NFATc4是病理性心肌肥大的重要轉錄調控因子，過表達構成性激活的NFATc4突變蛋白可誘導心肌肥大的發生；而過表達顯性負突變的NFATc4蛋白可抑制內皮素1(endothelin-1，ET-1)、苯腎上腺素(phenylephrine,PE)或血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)誘導的心肌細胞肥大[7]。近年來，炎癥反應在心肌肥大中的作用受到廣泛關注。Kawano等[8]發現在ET-1、PE或AngⅡ誘導的心肌細胞肥大中，NF-κB的表達明顯上調，而抑制NF-κB能明顯減少肥大反應。大量的研究結果證實，轉錄因子NFATc4和NF-κB在病理性心肌肥大的發病過程中均發揮重要的調控作用，它們在結構中均有Rel同源結構域(Rel homology domain，RHD)，這是蛋白質之間相互作用的結構基礎。因此，我們推測兩者在心肌細胞內可能存在相互作用，并有可能形成轉錄復合體參與對心肌肥大的調控。本文重點研究核受體PPARα與核轉錄因子NFATc4、NF-κB在心肌肥大中的相互作用及信號聯系，為進一步探索心肌肥大的發病機制和治療靶點提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

抗小鼠PPARα的單克隆抗體(P0869)和非諾貝特(F6020)購自Sigma；NFATc4 (sc-13036)和p-NFATc4(sc-68710)抗體購自Santa Cruz；p65(ab7970-1)抗體購自Abcam；ECL化學發光檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce。

2 方法

2.1乳鼠心肌細胞培養 取1～2 d SD乳鼠，用胰蛋白酶消化法(置冰上消化20 min后，37 ℃水浴中多次消化)將乳鼠左心室消化成單細胞懸液，在差速貼壁分離后，調節細胞密度至5×105/L接種于培養皿中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，并加入0.1 mmol/L BrdU抑制成纖維細胞生長。在培養48 h后更換為無血清培養基并加入試劑，用于后續實驗。

2.2Real-time PCR 按照Trizol說明書步驟提取細胞總RNA，利用紫外分光光度儀測定RNA濃度與純度。參照TaKaRa有限公司逆轉錄PCR試劑盒說明書進行逆轉錄反應。采用兩步法進行PCR擴增，分別加入熒光染料、引物序列和逆轉錄產物后在real-time PCR儀中進行反應。參數設置: 30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。引物由上海生工設計合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.3免疫共沉淀及Western blotting 按照Active Motif核蛋白抽提試劑盒說明書提取細胞核蛋白，將核蛋白(200 μg)與抗體或瓊脂糖珠混合置4 ℃，緩慢搖擺過夜。瓊脂糖珠經緩沖液洗滌，提取蛋白進行Western blotting。SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜，將PVDF膜置于5% BSA封閉液中室溫封閉1 h后加入Ⅰ抗，孵育過夜。用TBST洗膜后加入Ⅱ抗并在室溫孵育1 h。加入ECL試劑，曝光，顯影，定影。

2.4電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA) 按照Pierce的EMSA試劑盒說明書，配制非變性PAGE膠，準備核蛋白的結合反應，依次加入Poly(dI:dC)、核蛋白和生物素標記的探針，室溫放置20 min。4 ℃、100 V，電泳70～80 min，直至溴酚藍遷移到膠長的2/3 或3/4處，轉膜。將膜置于254 nm紫外燈下交聯10～15 min。每張膜加入10 mL封閉液，室溫封閉60 min，然后加入穩定的鏈親和素-辣根過氧化物酶交聯物(SA-HRP)，曝光，顯影，定影。

3 統計學處理

數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，用SPSS 17.0統計軟件分析，組間均數比較采用單因素方差分析。采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 非諾貝特抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大

原代培養的心肌細胞先用非諾貝特(10 μmol/L)預處理1 h后，再加入100 nmol/L的AngⅡ處理24 h。AngⅡ刺激24 h后，肥大標志物心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor,ANF)、BNP和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)mRNA水平升高，心肌細胞表面積也明顯增加。非諾貝特預處理能明顯抑制AngⅡ誘導的ANF、BNP和β-MHC mRNA水平增高，以及心肌細胞表面積的增加，見圖1。

Figure 1. Effects of fenofibrate (Feno) on the cardiomyocyte hypertrophy induced by AngⅡ. A: the mRNA levels of atrial natriuretic factor (ANF), brain natriuretic peptide (BNP) and β-myosin heavy chain (β-MHC) detected by real-time PCR; B: the cell surface area detected by rhodamine-phalloidin and DAPI staining (×500). Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AngⅡ.

2 非諾貝特抑制AngⅡ誘導的NFATc4與p65-NFκB的核轉位以及兩者之間的相互作用

如圖2A所示，AngⅡ(100 nmol/L)處理6 h后，NFATc4與p65-NFκB的入核明顯增加；而用非諾貝特預處理后能明顯抑制NFATc4與p65-NFκB的核轉位。如圖2B所示，AngⅡ(100 nmol/L) 刺激明顯增強心肌細胞核內NFATc4與p65-NFκB之間的相互結合；而用非諾貝特預處理后，兩者之間的相互作用明顯減弱。這表明非諾貝特抑制轉錄因子NFATc4和p65-NFκB的轉位入核，以及兩者在心肌細胞核內的相互作用，可能是其抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大的重要機制。

Figure 2. The effects of fenofibrate (Feno) on the nuclear translocations (A) and interaction (B) of NFATc4 and p65 induced by AngⅡ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs AngⅡ.

3 干預p65-NFκB對心肌細胞核內NFATc4與PPARα或p65-NFκB相互作用的影響

如圖3A、B所示，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)能明顯增加心肌細胞核內p65-NFκB的表達，而二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)可明顯減少心肌細胞核內p65-NFκB的表達。PDTC能明顯抑制由AngⅡ引起的NFATc4與p65-NFκB間的相互作用，而TNF-α可取消非諾貝特對AngⅡ誘導的PPARα與NFATc4，以及NFATc4與p65-NFκB之間相互 作用的影響，見圖3C、D。

Figure 3. Effects of activation or inhibition of NF-κB on the interaction of NFATc4 with PPARα or p65-NFκB. The cardiomyocytes were treated with 0～20 μg/L TNF-α (A) or 0～100 μmol/L PDTC (B) for 6 h, and the nuclear protein expression of p65-NFκB was detected by Western blotting. Furthermore, the cardiomyocytes were pretreated with or without fenofibrate (Feno, 10 μmol/L), TNF-α (20 μg/L) and/or PDTC (100 μmol/L) for 1 h followed by AngⅡ (100 nmol/L) stimulation for 24 h, and the interactions of NFATc4 with PPARα (C) and NFATc4 with p65-NFκB (D) in the nucleus were determined by co-immunoprecipitation. *P<0.05,**P<0.01 vs control (no treatment); #P<0.05 vs AngⅡ alone; △P<0.05 vs co-treatment with AngⅡ and Feno.

4 非諾貝特對AngⅡ誘導的NFATc4在BNP啟動子上DNA結合活性的影響

研究表明，NFATc4可以直接結合在肥大相關基因的啟動子，調控肥大基因的表達[9]。我們在大鼠BNP啟動子上-330/-351區間發現有一個可疑的NFATc4的保守結合序列，我們依此設計了一條探針，并在3’端標記了生物素。如圖4所示，AngⅡ可顯著增強NFATc4在BNP啟動子上的DNA結合活性；用非諾貝特或PDTC預處理1 h可明顯減弱AngⅡ誘導的NFATc4 DNA結合活性的增強;非諾貝特對AngⅡ誘導的NFATc4 DNA結合活性的抑制作用可被TNF-α所取消。

Figure 4. Effects of PPARα activation on NFATc4 binding to BNP promoter in the cardiomyocytes stimulated by AngⅡ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AngⅡ alone; △P<0.05 vs co-treatment with AngⅡand fenofibrate (Feno).

討 論

我們發現PPARα激動劑非諾貝特在體外能夠顯著抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。給予非諾貝特后，心肌細胞核內PPARα與NFATc4之間的相互作用明顯增強，同時伴隨著NFATc4與p65-NFκB之間相互作用的減弱，進而抑制了NFATc4在BNP啟動子上的DNA結合活性以及肥大標志物的表達。此外，我們還發現非諾貝特的上述效應可被對NF-κB具有較強激動作用的TNF-α取消。這些實驗結果有助于進一步理解非諾貝特抗心肌肥大作用的機制，并為通過干預轉錄因子相互作用從而防治心肌肥大提供了初步的實驗依據。

研究表明，NF-κB參與了病理性心肌肥大的分子調控[10-11]。在靜息狀態下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合，主要存在于胞漿中。當IκB被磷酸化降解后，NF-κB可快速入核并引起心肌肥大[8，12]。NFATc4和NF-κB在其結構中均包含RHD同源結構域，這是蛋白質之間相互作用的結構基礎[13]。AngⅡ被廣泛用于體外心肌肥大的機制研究，AngⅡ刺激可以激活NFATc4和NF-κB信號通路[14-15]。我們發現AngⅡ刺激能夠明顯增強NFATc4與p65-NFκB從胞漿向胞核的轉移，并增強心肌細胞核內NFATc4與p65-NFκB的相互作用，同時伴隨著肥大標志物ANF、BNP和β-MHC mRNA表達明顯上調。用非諾貝特預處理后可明顯抑制AngⅡ誘導的NFATc4與p65-NFκB的核轉位和心肌細胞核內NFATc4與p65-NFκB之間的相互作用，以及肥大標志物的表達。這表明NFATc4與p65-NFκB之間的相互作用在心肌肥大的信號調控中發揮了重要作用。

我們發現非諾貝特預處理可顯著抑制AngⅡ誘導的NFATc4在BNP啟動子上的結合活性，并降低BNP mRNA和蛋白表達水平。為進一步證實PPARα對NFATc4轉錄活性的影響是否與NFATc4與p65-NFκB之間的相互作用有關，我們采用對NF-κB具有較強激動作用的TNF-α[13-14]和抑制劑PDTC[15]對心肌細胞進行預處理。Western blotting結果顯示，TNF-α明顯增加心肌細胞核內p65-NFκB的蛋白表達，而PDTC則顯著抑制p65-NFκB在細胞核內的表達。此外，我們發現TNF-α明顯增強心肌細胞核內NFATc4/p65-NFκB之間的相互作用，并減弱非諾貝特誘導的NFATc4/PPARα之間相互作用，逆轉非諾貝特對AngⅡ誘導的NFATc4轉錄活性的抑制作用。而PDTC預處理后，可顯著抑制AngⅡ誘導的NFATc4/p65-NFκB之間的相互作用以及NFATc4在BNP啟動子上DNA結合活性的增加。

綜上所述，在AngⅡ的作用下，NFATc4去磷酸化轉位入核，在細胞核內NFATc4與p65-NFκB發生相互作用形成轉錄復合體并結合到靶基因BNP啟動子上，啟動BNP的轉錄，最終導致心肌肥大的發生。非諾貝特預處理激活PPARα后，活化的PPARα進入細胞核內并與NFATc4發生相互作用，這種相互作用可以抑制NFATc4/p65-NFκB轉錄復合體的形成，阻止NFATc4結合到BNP啟動子序列上，抑制BNP的轉錄，進而抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。

[參 考 文 獻]

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