李伊倩, 陳俊榕, 李初俊△, 趙睿穎, 楊惠玲, 朱穎鈺, 蔡清紅, 胡思源

(1中山大學附屬第六醫院，廣東 廣州 510655； 2哥倫比亞大學生物科學系, 美國 紐約 10027；3中山大學中山醫學院病理生理教研室，廣東 廣州 510080)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見的惡性腫瘤，2012年中國腫瘤登記年報顯示結直腸癌的發病率居全國惡性腫瘤的第3位，死亡率居第5位。腺瘤-腺癌惡變途徑[1]是目前公認的CRC發生最重要的途徑,2/3以上的CRC由腺瘤進展而來，腺瘤越大、形態越不規則、絨毛含量越高、上皮異型增生程度越重，癌變機會越大[2]。但目前其癌變途徑和分子機制尚不明確，結直腸癌的早期篩查工作開展困難，超過一半的患者在確診時腫瘤細胞已經發生轉移，因此研究腺瘤癌變機制，為結直腸癌的早發現、早診斷和早治療提供新方法至關重要。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是目前國內外關于細胞增殖、分化與腫瘤發生、發展、治療及預后等相關領域的研究熱點。C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)為內質網應激的關鍵分子標志物，被認為是內質網應激時使細胞程序性凋亡的一種重要的內質網應激相關蛋白[3]，CHOP的促癌作用可能機制為其選擇性促進細胞凋亡，并進一步啟動細胞再生[3]。細胞的增殖和凋亡失衡與腫瘤的發生、發展密切相關。正常生理狀況下，結直腸黏膜上皮細胞不斷更新，增殖和凋亡處于相對平衡狀態，從而保證機體結構和功能正常。一旦增殖和凋亡失衡，將會影響細胞的數量和質量甚至導致結直腸腫瘤的發生和發展。本課題組陳俊榕等[4]已通過檢測多例不同遺傳背景條件下結直腸腺瘤及腺癌組織中CHOP蛋白表達及細胞凋亡水平，結果表明CHOP及細胞凋亡可能參與結直腸腺瘤癌變過程。CHOP蛋白可以促進腫瘤的發生發展與其促進腫瘤細胞的凋亡兩者似乎矛盾。但是我們猜想CHOP在促凋亡的同時，可能也會誘發其靶基因TRB3(Tribbles homolog 3)的反饋調節[5]，及受其它多種促生存調節信號的影響，從而促進細胞生存，最終使細胞增殖和凋亡失衡，腫瘤細胞失控性生長，導致腫瘤發生發展。因此，深入研究結直腸腺瘤癌變不同階段組織中細胞增殖和凋亡的關系及其調節機制，對了解結直腸癌的生物學行為及發病機制有重要的意義。本研究檢測具有相同遺傳背景的多組伴低級別上皮內瘤變腺瘤、伴高級別上皮內瘤變腺瘤、腺癌手術切除標本及對應正常腸黏膜中CHOP表達水平、細胞增殖指數(proliferative index,PI；即Ki-67陽性細胞率)和細胞凋亡指數(apoptotic index,AI)，首次研究相同遺傳背景下結直腸腺瘤-癌組織序列CHOP、細胞增殖/凋亡比率(proliferative/apoptotic ratio,PAR)的變化及兩者之間的關系，從ERS角度及細胞增殖及凋亡失衡角度闡明結直腸腺瘤癌變機制，尋找CRC早發現、早診斷和早治療的新方法。

材 料 和 方 法

1 材料

收集中山大學附屬第六醫院2009年1月1日至2013年1月1日行電子結腸鏡下及手術切除的23例病人的伴低級別上皮內瘤變腺瘤(伴輕、中度異型增生的腺癌)、伴高級別上皮內瘤變腺瘤(包括伴重度異型增生的腺瘤、原位癌和黏膜內癌)和腺癌石蠟切片標本，及每一例病人的癌旁正常腸黏膜(指結直腸癌手術切除標本最遠端的腸黏膜組織，病理確證無癌細胞浸潤)。其中女性10例，男性13例；年齡35～78歲，平均年齡63.5歲；直腸癌16例，結腸癌7例；按照腸癌Dukes分期標準，Dukes A期5例，Dukes B期9例，Dukes C期8例，Dukes D期1例；按照WHO新分類標準[6]高分化腺癌9例，中分化腺癌12例，低分化腺癌2例。所有組織標本均經10%甲醛固定、脫水并常規石蠟包埋；4 μm連續切片，貼在經Poly-Lysine防脫片處理的防脫載玻片上，置60 ℃烤箱烘烤90 min備用；所有切片標本均經HE染色病理確證。已排除術前行放療及化療者、家族性腺瘤性息肉病患者。

2 方法

2.1免疫組化SABC法 CHOP多克隆兔Ⅰ抗(F-168)及Ki-67單克隆鼠Ⅰ抗均購自Santa Cruz；SABC免疫組化染色試劑盒(含5%BSA封閉液，兔Ⅱ抗或鼠Ⅱ抗，SABC反應液：鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物)購自武漢博士德生物工程有限公司；二氨基聯苯胺(diaminobenizidine, DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。主要實驗步驟如下：(1)烤片，常規脫蠟及水合；(2)消除內源性過氧化物酶：置于3%過氧化氫溶液中反應15 min，蒸餾水洗5 min×3次；(3)微波修復抗原：玻片浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液，置于微波爐中微波3 min×4次，并自然冷卻至室溫，蒸餾水洗5 min×3次，免疫組化畫圈筆在組織塊周圍畫圈，PBS洗5 min×3次；(4)血清封閉：5%BSA封閉20 min，甩干；(5)Ⅰ抗孵育：Ⅰ抗稀釋液將Ⅰ抗稀釋至適當比例(CHOP 1∶50，Ki-67 1∶50)，滴至組織上將組織覆蓋，置于4 ℃冰箱中過夜，并復溫20 min，PBS洗5 min×3次；(6)孵育Ⅱ抗；分別滴加兔Ⅱ抗及鼠Ⅱ抗常溫反應30 min, PBS洗5 min×3次；(7)SABC級聯反應：滴加SABC反應液常溫反應30 min, PBS洗5 min×3次；(8)DAB染色3～5 min, PBS洗5 min×3次；(9)蘇木素復染20 s,自來水沖洗；(10)1%鹽酸乙醇分化3 s；(11)脫水及透明；(12)常溫自然風干、中性樹膠封片、蓋片；(13)光學顯微鏡觀察。

2.2TUNEL法 根據南京凱基TUNEL凋亡細胞檢測試劑盒(FITC標記法)說明書進行檢測。具體步驟如下：(1)60 ℃烤片1 h，脫蠟及水合；(2)1%Triton X-100 通透液通透5 min；(3)滴加蛋白酶K于 37 ℃反應30 min，PBS漂洗10 min；(4)3%H2O2常溫封閉10 min，以阻斷其內源酶，PBS漂洗10 min；(5)滴加TdT酶反應液，加蓋玻片37 ℃濕潤避光反應60 min，PBS漂洗15 min；(6)滴加鏈霉親和素-FITC標記工作液，加蓋玻片37 ℃避光濕潤反應60 min，PBS漂洗30 min；(7)熒光顯微鏡觀察：激發波長450～500 nm，發射波長515～565 nm。

3 結果判讀

3.1CHOP及Ki-67表達結果 采用雙盲法顯微鏡觀察并計數。用已知CHOP陽性乳腺癌組織及Ki-67陽性扁桃腺細胞免疫組化結果作為陽性對照，不滴加Ⅰ抗的腸癌組織作為陰性對照。可見CHOP蛋白表達于細胞質和細胞核中，呈棕黃色；Ki-67全部表達于細胞核中，呈棕褐色。根據DAB染色結果，參照Ishida[7]判定標準進行結果判定：隨機選取5個細胞富集、染色均勻的200倍視野，分別對染色陽性細胞及陰性細胞進行計數，5個視野陽性細胞百分率的平均值作為陽性細胞百分率，Ki-67陽性細胞百分率為PI。

3.2TUNEL法檢測凋亡結果 采用雙盲法顯微鏡觀察并計數。用DNA酶處理的腸黏膜組織作為陽性對照，不滴加TdT酶的腸癌組織作為陰性對照。熒光顯微鏡可見凋亡陽性的細胞激發出綠色熒光。連續觀察5個200倍視野, 5個視野陽性細胞百分率的平均值即AI[7]。

4 統計學處理

采用SPSS 16.0，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，利用隨機區組設計的方差分析及Bonferroni多重比較方法，利用定量資料的關聯分析方法分析CHOP表達水平和PAR之間的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 相同遺傳背景結直腸腺瘤-癌組織序列CHOP蛋白表達

腸癌標本PBS代替Ⅰ抗者呈陰性表現，正常腸黏膜CHOP蛋白少量表達于細胞核和細胞漿，腺瘤和腺癌組織CHOP表達明顯增加，分布于細胞核和細胞漿，見圖1。正常腸黏膜、伴低級別上皮內瘤變腺瘤、伴高級別上皮內瘤變腺瘤及腺癌CHOP表達陽性細胞百分率，見表1；相同遺傳背景腺瘤癌變序列組織中CHOP陽性細胞百分率差異比較有統計學意義(P<0.01)。CHOP在結直腸腺癌組織中的陽性細胞率顯著高于伴高級別上皮內瘤變腺瘤、伴低級別上皮內瘤變腺瘤和正常腸黏膜(P<0.01)；伴高級別上皮內瘤變腺瘤中的陽性細胞率顯著高于伴低級別上皮內瘤變腺瘤和正常腸黏膜(P<0.01)，伴低級別上皮內瘤變腺瘤中的陽性細胞率顯著高于正常腸黏膜(P<0.01)。

Figure 1. CHOP expression detected by immunohistochemistry SABC method.A: HE staining(×200); B: negative control (×400); C:normal mucosa (×200); D: adenoma with low-grade intraepithelial neoplasia (×200); E: adenoma with high-grade intraepithelial neoplasia (×200); F:colorectal adenocarcinoma (×200); G: colorectal adenocarcinoma (×400).

2 相同遺傳背景結直腸腺瘤-癌組織序列增殖與凋亡比率PAR表達差異分析

腸癌標本PBS代替Ⅰ抗者呈陰性表現，正常腸黏膜Ki-67少量表達于細胞核，腺瘤和腺癌組織Ki-67表達明顯增加，分布于細胞核，見圖2。用DNA酶處理的正常腸黏膜組織呈明顯陽性表現，不滴加TdT酶的腸癌組織呈陰性表現。熒光顯微鏡可見凋亡陽性的細胞激發出綠色熒光，分布于細胞核，見圖3。正常腸黏膜、伴低級別上皮內瘤變腺瘤、伴高級別上皮內瘤變的腺瘤及腺癌PI、AI和PAR見表1；相同遺傳背景腺瘤癌變序列組織PAR差異比較有統計學意義(P<0.01)。PAR在結直腸腺癌組織顯著高于伴高級別上皮內瘤變腺瘤(P<0.01)、伴低級別上皮內瘤變腺瘤和正常腸黏膜(P<0.01)；伴高級別上皮內瘤變腺瘤顯著高于伴低級別上皮內瘤變腺瘤和正常腸黏膜(P<0.01)，伴低級別上皮內瘤變腺瘤顯著高于正常腸黏膜(P<0.01)。

3 相同遺傳背景結直腸腺瘤-癌組織序列CHOP蛋白表達及PAR關系分析

CHOP蛋白表達和PAR關聯性分析結果顯示，在伴低級別上皮內瘤變中CHOP蛋白表達水平和PAR的Pearson相關系數r=0.641(P<0.01)；在高級別上皮內瘤變中兩者Pearson相關系數r=0.867(P<0.01)；在腺癌組織中兩者Pearson相關系數r=0.930，P<0.01；所以可以認為CHOP蛋白表達水平和PAR在結直腸腺瘤-癌組織序列變化過程中呈正相關關系。

討 論

內質網是真核細胞生物的一種重要的細胞器，是蛋白質合成、折疊和運輸以及細胞內Ca2+儲存的主要場所。缺氧、糖剝奪及鈣離子穩態失衡等[8-9]多種病理因素造成未折疊或者異常折疊蛋白在內質網大量堆積，從而導致ERS。細胞通過啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，降低蛋白合成速度，恢復細胞內環境穩態，從而維持細胞的正常功能。但如果應激過于強烈、持久，內環境紊亂無法糾正，內質網穩態不能及時恢復，則相應凋亡機制被激活以誘導細胞凋亡[10]。內質網應激介導凋亡的通路主要包括caspase-12的活化通路、IRE1-JNK信號通路、促凋亡編碼基因CHOP通路。CHOP通路是內質網應激介導凋亡的一個重要的通路。CHOP屬于C/EBP轉錄因子家族成員，也叫生長抑制及DNA損傷誘導蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153，GADD153)或DNA損傷誘導轉錄本3(DNA damage-inducible transcript 3， DDIT3)，與各種細胞活動(如增殖、分化、凋亡及能量代謝)相關。正常情況下，CHOP表達水平普遍低下，當發生內質網應激時，內質網應激通路相關蛋白PERK和ATF6的活化均可促進CHOP的表達顯著增加[11]，從而促進細胞凋亡。CHOP已被證實與多種非腫瘤性疾病如子癇、阿爾茨海默病和腦缺血發病相關，同時其也與多種腫瘤性疾病如子宮內膜癌[12]、黏液樣脂肪肉瘤[13-14]和肝癌[15]的發生發展密切相關。目前關于CHOP與結直腸癌關系方面的研究很少，Rask等[16]研究發現CHOP在結腸癌組織中表達升高，與腫瘤的侵襲性相關。陳俊榕等[4]通過檢測多例結直腸腺瘤及腺癌組織中CHOP蛋白表達水平，結果表明CHOP可能參與結直腸腺瘤癌變過程[4]。本實驗通過研究相同遺傳背景條件下，正常腸黏膜-伴低級別上皮內瘤變腺瘤-伴高級別上皮內瘤變-腸癌序列癌變組織中CHOP蛋白的表達水平，發現隨著腺瘤癌變的進展，CHOP表達水平逐漸升高，說明了CHOP可能參與了結直腸腺瘤癌變過程，使其成為具有潛在應用價值的結直腸癌標志物和結直腸癌治療的新靶點。

Figure 2. Ki-67 expression detected by immunohistochemistry SABC methods.A: HE staining(×200); B: negative control (×400); C:normal mucosa (×200); D: adenoma with low-grade intraepithelial neoplasia (×200); E: adenoma with high-grade intraepithelial neoplasia (×200); F:colorectal adenocarcinoma (×200); G: colorectal adenocarcinoma (×400).

癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活使機體細胞的增殖和凋亡失衡，從而導致腫瘤發生和發展。已有研究證明增殖和凋亡相關蛋白如p53、Bcl-2、COX-2、β-catenin、APC、survivin、Bax、EGFR及IGF-1等可以影響腫瘤的發生發展[17]、放化療敏感性[18]及復發風險性[19]。對于增殖、凋亡和結直腸腫瘤生物學行為之間的關系，目前國內外研究結果尚未達成一致的觀點。Kubbuutat等[20]認為Ki-67抗原在結直腸癌中的表達水平與腫瘤大小、轉移情況及預后呈正相關，其可作為判斷結直腸癌預后的參考指標。Anjomshoaa等[21]研究了73例原發結直腸癌和27例肝轉移癌的Ki-67的表達，結果表明低增殖率是結直腸癌轉移病灶和其原發病灶的生物學特征。Kikuchi等[22]檢測了結直腸腺瘤癌變組織及腺癌組織中Ki-67表達及凋亡指數，結果表明隨著結直腸腺瘤癌變進展Ki-67增殖指數升高，而凋亡指數下降。本實驗通過研究同一個體、相同遺傳背景下的腺瘤-腺癌轉變過程中增殖和凋亡情況的變化，發現隨著腺瘤癌變進展，PAR逐漸升高。與Kikuchi等[22]的結果一致。進一步說明腺瘤惡變過程中，細胞增殖及凋亡失衡，細胞失控性生長，導致瘤體積增大呈膨脹性生長，此過程可能參與了結直腸腺瘤的癌變。

表1 結直腸腺瘤癌變不同階段組織CHOP表達水平、PI、AI及PAR

*P<0.05vsnormal mucosa;#P<0.05vsadenoma with low-grade intraepithelial neoplasia;?P<0.05vsadenoma with high-grade intraepithelial neoplasia.

腫瘤的增殖或者凋亡，反映的只是腫瘤細胞動力學的一個相對獨立指標，不能完全反應腫瘤的生物學行為，因此研究結直腸癌變過程中增殖和凋亡的比率，并結合具體信號通路過程更能說明結直腸腺瘤癌變的發病機制。如Aotake等[23]檢測了腺瘤癌變序列組織中細胞凋亡指數、Ki-67增殖指數以及反映細胞缺氧程度的微血管密度，從血管生成及細胞增殖、凋亡失衡角度說明增殖增加、凋亡減少及缺氧同時參與結直腸腺瘤癌變過程；Valcz等[24]人通過檢測13例正常腸黏膜、伴低級別上皮內瘤變腺瘤、伴高級別上皮內瘤變腺瘤及腺癌中骨橋蛋白(osteopontin，OPN)表達及PAR，結果表明結直腸腺瘤癌變序列組織中OPN及PAR逐漸升高，從OPN及細胞增殖、凋亡失衡方面說明了結直腸腺瘤癌變的可能機制 。本實驗從內質網應激角度探討結直腸腺瘤癌變機制，表明隨著腺瘤惡變程度的加深，增殖/凋亡比率逐漸升高。提示內質網應激通路在結直腸腺瘤癌變進展過程中除了發揮細胞凋亡的作用外，可能會通過其它途徑如誘發其靶基因TRB3的反饋調節[5]，從而促進細胞生存，調節細胞增殖、生長，改變腫瘤細胞增殖與凋亡的平衡狀態，使細胞失控性生長，從而促進腫瘤惡變。同時，結直腸腺瘤在癌變過程中細胞增殖/凋亡比率逐漸升高，細胞失控性生長，組織呈膨脹性生長且生長速度加快，可能造成缺氧、糖剝奪等內質網應激狀態，使內質網應激程度進一步加深，從而導致內質網應激主要蛋白CHOP升高。但具體的機制及確切通路尚需進一步研究

總之，本實驗首次研究相同遺傳背景結直腸腺瘤-癌組織序列中CHOP表達水平、PAR以及兩者之間的關系。本研究結果表明相同遺傳背景結直腸腺瘤-癌組織序列中CHOP蛋白表達和細胞增殖/凋亡比率逐漸升高，提示CHOP和細胞增殖及凋亡異常可能共同參與結直腸腺瘤癌變過程，為下一步研究內質網應激與結直腸腺瘤癌變關系奠定基礎。

[參 考 文 獻]

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