攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達質粒的減毒沙門菌對前列腺癌移植瘤的體內抑制作用*

趙曉暉， 蘆麗莉， 葛 賀， 李 冰， 趙雪儉， 劉艷波△

(1北華大學基礎醫學院病理生理學教研室，吉林 吉林 132013； 2吉林大學前列腺疾病防治研究中心，吉林 長春 132001)

前列腺癌(prostate cancer，pCa)是美國男性癌癥死亡的第二大原因，2010年，估計美國有217 030例前列腺癌患者被確診，約32 050人死于該病[1]。目前我國前列腺癌發病率也呈逐漸增加趨勢。pCa具有侵襲性及耐藥性特點[2]，而前列腺癌根治術并發癥較多，對轉移的前列腺癌幾乎無作用[3]。存活蛋白(survivin)是1997年確定的一種凋亡抑制蛋白，能抑制細胞凋亡和調節細胞增殖，在大多數惡性腫瘤中高表達，有研究證實survivin表達在前列腺癌中異常升高。GRIM-19蛋白是GRIM家族的一個新成員，為一種新的腫瘤抑制蛋白。研究表明，GRIM-19在許多正常組織中高表達，但在多種癌癥中低表達或沒有表達，有研究證實在人前列腺癌組織中GRIM-19表達缺失。另一方面，GRIM-19可以增強細胞對干擾素β聯合維甲酸誘導的細胞凋亡，同時獲得自身死亡活化[4]。本研究在前期工作成功構建pGRIM-19-si-survivin 共表達質粒的基礎上，以減毒沙門菌作為運載體，觀察其對裸鼠前列腺癌皮下移植瘤的抑瘤效應，并探討相關機制。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性裸鼠，30只，4～6周齡，質量18～20 g，購于中國醫學科學院實驗動物研究所。

2 主要材料

psi-survivin質粒、psi-scramble質粒、pGRIM-19質粒、pGRIM-19-si-survivin重組質粒和DU145細胞株由吉林大學前列腺疾病防治研究中心饋贈；減毒人傷寒沙門氏菌Ty21a由美國馬里蘭大學胡嘉娣教授饋贈；JM109大腸桿菌由本研究室保存；兔抗人survivin單克隆抗體購自Santa Cruz；鼠抗人Ki67單克隆抗體購自Abcom；二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉試劑公司；Trizol試劑為Invitrogen;TUNEL試劑盒購于南京建成生物試劑公司；引物合成及測序由上海生工生物工程技術服務公司完成。

3 方法

3.1重組表達質粒轉化減毒人傷寒沙門氏菌 分別將psi-scramble、psi-survivin、pGRIM-19和PGRIM-19-si-survivin質粒轉化人減毒沙門菌Ty21a。

3.2裸鼠前列腺癌皮下移植瘤的構建及治療 將DU-145細胞調整到2.5×1010cells/L，取0.2 mL接種于裸鼠左側背部皮下。20 d后，在無菌條件下取出瘤組織塊，將瘤組織分成直徑約2 mm的瘤塊植入另外30只裸鼠皮下。待移植瘤長至直徑約7 mm時將裸鼠隨機分為6組，即mock組(PBS作為對照)、單純減毒沙門氏菌組、沙門菌攜帶的psi-scramble組、psi-survivin組、pGRIM-19組和pGRIM-19-si-survivin治療組，每組5只動物，裸鼠腹腔注射含有上述質粒的減毒沙門菌20 μL (108cfu/100 μL)，每周2次監測裸鼠皮下移植瘤體積，直至70 d處死。裸鼠體積按以下公式進行計算：V=L×W2×0.52，L為腫瘤的長徑，W為腫瘤的短徑。繪制腫瘤的生長曲線并計算抑瘤率(inhibitory rate，IR)，IR(%)=(1-治療組瘤重/對照組瘤重)×100%。

3.3病理學檢查及免疫組織化學染色 取10%甲醛固定后的組織，石蠟包埋，組織切片4 μm，進行HE染色，各種動物腫瘤組織進行survivin、GRIM-19和Ki67的免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察，拍照并記錄實驗結果。

3.4腫瘤組織相關蛋白的mRNA表達 利用Trizol試劑提取pCa移植瘤組織內總RNA，RT-PCR擴增survivin、GRIM-19、 caspase-3、Bcl-xL、c-Myc、Stat3、cyclin D1、VEGF和內參照β-actin,引物序列與參考文獻[5]相同。

3.5TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡 切片常規脫蠟入水，新鮮配制的3% H2O2室溫處理10 min，PBS洗3 min×3次，組織用胰蛋白酶37 ℃水浴消化30 min，PBS洗3 min×3次，加TUNEL檢測液，每片50 μL，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3 min×3次，滴加 DAB顯色，PBS洗3 min×3次，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。每個切片觀察5個視野，每個視野連續數300個細胞，計數凋亡細胞百分比即為凋亡指數(apoptotic index，AI)。AI(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

4 統計學處理

數據用均數±標準誤 (mean±SEM) 表示，SPSS 11.0統計軟件進行方差分析和SNK-q檢驗，用Excel作圖，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 重組質粒對裸鼠前列腺癌皮下移植瘤的抑制作用

DU145細胞接種裸鼠皮下2周后，可見裸鼠前列腺癌移植瘤模型復制成功。隨后將移植塊接種裸鼠皮下，連續監測腫瘤的生長情況，并繪制腫瘤生長曲線，見圖1、2。從第15天開始腹腔注射攜帶不同質粒的減毒沙門菌，用游標卡尺測量腫瘤體積，監測腫瘤的生長情況。從第35天開始，共表達質粒組與對照組及單基因質粒組相比，腫瘤體積開始明顯縮小，差異有統計學意義(P<0.05)；70 d 處死動物時，攜帶共表達質粒的減毒沙門菌組其腫瘤體積為(284.33±57.33) mm3，攜帶psi-survivin組腫瘤體積為(671.36±165.11)mm3，攜帶pGRIM-19組減毒沙門菌腫瘤體積為(857.29±170.07)mm3，前者與后兩者比較，腫瘤體積分別減少2.36和3.02倍，治療效果明顯(P<0.05)。

Figure 1. Intraperitoneal injection of S. typhi carrying pGRIM-19, psi-survivin and pGRIM-19-si-survivin plasmids resulted in significant inhibition of DU145 tumor growth in vivo. A: mock; B: S. typhi; C: psi-scramble; D: pGRIM-19; E: psi-survivin; F: pGRIM-19-si-survivin.

Figure 2. Growth curves of DU145 xenografts treated with recombinant plasmids.Arrows: plasmid treatment.Mean±SEM.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control (mock, S.typhi or psi-scramble); #P<0.05 vs pGRIM-19 or psi-survivin.

2 腫瘤組織survivin和GRIM-19的蛋白免疫組化檢測

由圖 3 可見，GRIM-19蛋白主要表達于腫瘤細胞的胞漿，少部分表達于胞核。圖4表明survivin蛋白主要表達于腫瘤細胞的胞漿，顯棕黃色，也有部分位于胞核內。攜帶pGRIM-19-si-survivin沙門菌治療組腫瘤細胞內survivin表達明顯低于攜帶psi-scramble減毒沙門菌治療組；而GRIM-19的表達明顯增加(P<0.05)，從而說明攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達質粒減毒沙門菌可有效提高腫瘤組織內GRIM-19蛋白含量，同時降低survivin蛋白的表達。

3 腫瘤組織Ki67免疫組化染色

如圖5所示，攜帶psi-scramble減毒沙門菌治療組Ki67表達呈強陽性，顯棕黃色，攜帶psi-survivin和pGRIM-19質粒的減毒沙門菌治療組Ki67表達不同程度減弱，而攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達質粒減毒沙門菌組減弱更明顯(P<0.05或P<0.01)。

Figure 3. Immunohistochemical analysis of GRIM-19 expression in DU145 xenografts treated with S. typhi carrying psi-scramble and pGRIM-19-si-survivin plasmids(×400).

Figure 4. Immunohistochemical analysis of survivin expression in DU145 xenografts treated with S. typhi carrying psi-scramble and pGRIM-19-si-survivin plasmids(×400). Arrows indicate the positive cells with yellow color.

Figure 5. Immunohistochemical analysis of Ki67 expression in DU145 xenografts treated with S. typhi carrying diffe-rent plasmids (×400).Arrows indicate the positive cells with yellow color.

4 腫瘤組織GRIM-19和survivin mRNA表達分析

RT-PCR顯示(圖6)，survivin mRNA表達在mock組、攜帶psi-scramble減毒沙門菌組和單純減毒沙門菌組無顯著差異(P>0.05)；而攜帶psi-survivin減毒沙門菌治療組、pGRIM-19減毒沙門菌治療組和pGRIM-19-si-survivin減毒沙門菌治療組survivin mRNA表達減弱，以共表達質粒組降低最明顯(P<0.05)。而GRIM-19 mRNA在mock組、攜帶psi-scramble減毒沙門菌組和單純減毒沙門菌組表達基本缺失，攜帶pGRIM-19及共表達質粒組GRIM-19 mRNA表達明顯增強。

Figure 6. RT-PCR analysis of survivin and GRIM-19 mRNA in DU145 xenografts.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control (mock, S.typhi or psi-scramble); #P<0.05 vs psi-survivin or pGRIM-19.

5 RT-PCR 檢測腫瘤組織相關蛋白(caspase-3、Bcl-xL、c-Myc、Stat3、cyclin D1和VEGF)的mRNA表達

RT-PCR檢測發現(圖7)，與其它單基因對照組比較，攜帶共表達質粒的減毒沙門菌可明顯抑制腫瘤組織中Bcl-xL、c-Myc、Stat3、cyclin D1和VEGF mRNA表達，但同時增強caspase-3的表達(P<0.05或P<0.01)。

6 腫瘤組織細胞凋亡的檢測

TUNEL結果顯示，mock組動物腫瘤組織內鮮見凋亡細胞，而攜帶psi-survivin、pGRIM-19和pGRIM-19-si-survivin不同質粒的減毒沙門菌組可見TUNEL陽性反應細胞，即凋亡細胞，以pGRIM-19-si-survivin組細胞凋亡更明顯。如圖8所見，凋亡細胞表現為核固縮濃染，形狀不規則，并呈現棕黃色染色，與單基因治療組比較，差異顯著(P<0.05)。

Figure 7. The mRNA expression of apoptosis-related proteins caspase-3, Bcl-xL, c-Myc, Stat3, cyclin D1 and VEGF in the DU145 xenografts after intraperitoneal injection of recombinant bacteria carrying different plasmids.Mean±SEM.n=3.*P<0.05, ** P<0.01 vs control (mock, S.typhi or psi-scramble); #P<0.05,##P<0.01 vs psi-survivin or pGRIM-19.

討 論

腫瘤的發生是由多個基因共同調控的復雜過程。腫瘤治療最理想的方法是殺滅腫瘤細胞的同時盡量降低對正常細胞的損傷，通過基因治療方法可更準確地作用于癌細胞。腫瘤內部的缺氧環境是抵抗放化療的重要原因。減毒的沙門菌兼性厭氧生長，它作為基因運載體具有靶向傳遞目的基因的特點，可選擇性地在腫瘤組織中復制、表達編碼治療性蛋白效應基因等[6-7]。本文研究以減毒沙門菌為載體，攜帶si-survivin與GRIM-19共表達質粒對pCa進行治療。結果證實，減毒沙門菌本身在腫瘤早期階段具有一定的抗癌效果，與其增強免疫系統的活性有關。但攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達質粒的減毒沙門菌與單一基因治療組相比，腫瘤體積縮小更加明顯，通過免疫組化染色、RT-PCR等法檢測survivin表達被明顯抑制而GRIM-19表達上調，與體外的實驗結果相一致[8]，說明沙門菌可將攜帶的目的基因成功轉入細胞內發揮相應的作用。眾所周知survivin是凋亡抑制蛋白家族中非常重要的成員，Lim等[4]研究表明，survivin與前列腺癌發生、發展呈正相關，其主要通過抑制caspase活性阻斷細胞凋亡過程[9]。而干擾素β和維甲酸聯合應用誘導的細胞凋亡基因GRIM-19是新的抑癌基因，它能和Stat3反式激活結構域組合，抑制Stat3活性進而調控細胞的生長分化及凋亡過程[10]。Stat3沉默可使其下游如Bcl-2、Bcl-xL、cyclin D1、survivin和VEGF表達下調，p53和caspases表達上調，從而抑制了細胞的生長及增殖，其發生機制與細胞周期改變、細胞凋亡激活及抑制細胞增殖關系密切。因此本研究檢測了Bcl-xL、c-Myc、Stat3、cyclin D1和VEGF表達變化，為探討其相關機制奠定基礎。

Figure 8. Apoptosis in the DU145 xenografts after intraperioneal injection of recombinant bacteria carrying varions plasmids detected by TUNEL assay (×400).Arrows indicate the TUNEL-positive cells.

本研究運用RT-PCR對Bcl-xL表達進行了分析，結果證實與單基因治療組比較pGRIM-19-si-survivin共表達質粒抑制Bcl-xL表達的功能更強，雖然Bcl-xL與survivin呈相關性，但具體作用途徑不明確。c-myc基因是一種原癌基因，被激活后使細胞分裂加速，增殖加快，細胞甚至獲得永生化。c-Myc參與細胞凋亡，與多種腫瘤發生發展有關[11]，因為c-Myc通過JAK/Stat3信號轉導途徑激活，進而影響腫瘤的生長過程[12]。本研究表明， pGRIM-19-si-survivin共表達質粒組與單基因組相比較c-Myc表達明顯減弱，且pGRIM-19組低于psi-survivin組，說明GRIM-19直接使Stat3沉默，抑制c-Myc的激活，而survivin反向調節Stat3的作用很弱。Cyclin D1是細胞周期調節因子，Stat3抑制劑可抑制cyclin D1啟動子活性并使細胞生長停滯[13]。本實驗在RT-PCR中檢測到pGRIM-19-si-survivin共表達質粒組cyclin D1表達比單基因組低。VEGF是腫瘤血管生成的關鍵因素之一，對維持腫瘤細胞氧和營養物質供應具有重要意義。阻斷VEGF表達，可減少腫瘤組織內血管生成及血液供應，對治療腫瘤具有重要意義[14]。VEGF在腫瘤組織周圍高表達不但直接促使新生血管生成，而且還可誘導survivin表達，產生抗凋亡效應，VEGF又依賴于survivin，兩者相互影響，共同促進癌癥的發生及發展。本研究結果顯示，與單基因治療組比較,pGRIM-19-si-survivin共表達質粒明顯抑制VEGF表達，說明共表達基因可以通過GRIM-19對Stat3的作用控制VEGF，也可以通過survivin與VEGF的相關性來調節VEGF的表達。RT-PCR檢測Stat3和caspase-3的表達變化，從結果看出pGRIM-19-si-survivin共表達質粒明顯抑制Stat3表達但促進caspase-3的表達。

為了驗證pGRIM-19-si-survivin共表達質粒通過促進細胞凋亡達到治療腫瘤目的，本研究利用TUNEL染色法觀察了不同細胞的凋亡情況，結果證實與單基因治療組比較共表達質粒組促進細胞凋亡作用更明顯，凋亡率明顯增加，凋亡細胞表現為核固縮，染色質凝集等特點。從而也說明了腫瘤細胞生長的調控不是單一因素作用的，而是多因素共同作用的結果，單獨解決某個異常高表達的基因，不一定能完全達到治療腫瘤的目的[15]。

本研究又利用免疫組織化學染色法觀察Ki67的表達變化，結果顯示，與單基因治療組比較，聯合基因治療組前列腺癌細胞增殖能力降低，而與凋亡相關的因子Stat3、Bcl-xL和c-Myc表達降低，caspase-3表達增加，細胞凋亡增加。

終上所述，減毒沙門菌可作為基因治療的有效運載體，聯合基因治療方法較單基因治療更加有效，減毒沙門菌攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達質粒對前列腺癌皮下移植瘤的治療作用通過促進細胞凋亡及抑制細胞增殖過程實現的，具體凋亡信號轉導途徑還有待于進一步深入研究。

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