芬太尼聯合丙泊酚對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用

溫文++++++郭光偉++++++黃志剛++++++孫國棟++++++李曉輝

[摘要] 目的 探討芬太尼聯合丙泊酚作用于大鼠肺缺血再灌注損傷(I／R)模型后，對核因子-κB（nuclear factor-κB）表達的影響及其機制。方法 將40只雄性Wistar大鼠隨機分為5組（n=8）：假手術組（S組）、缺血再灌注損傷組（I/R組）、芬太尼干預組（F 組）,丙泊酚干預組（P 組），芬太尼聯合丙泊酚干預組（F+P組）。對大鼠動脈血進行血氣分析；檢測大鼠肺組織濕/干（W/D）值；對大鼠肺組織進行大體形態學及HE染色后鏡下病理學觀察，采用免疫組化法測定大鼠肺組織NF-κB表達水平的變化。 結果 與I/R組比較，F組、P組以及F+P組大鼠肺組織核因子-κB表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）；大鼠動脈血PaO2值升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；大鼠肺組織W/D值明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。I/R組肺毛細血管擴張充血，肺泡間質水腫并有炎性細胞浸潤，肺泡腔內可見炎性細胞滲出。假手術組（S組）、芬太尼干預組(F 組),丙泊酚干預組（P 組），芬太尼聯合丙泊酚干預組(F+P組)在肺泡結構較完整性，減輕肺間質及肺泡腔滲出、水腫肺組織保護方面均較I/R組明顯減輕。 結論 芬太尼聯合丙泊酚干預可顯著減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，可能是芬太尼聯合丙泊酚能降低大鼠肺組織NF-κB水平有關。

[關鍵詞] 芬太尼；丙泊酚；核因子-κB；缺血再灌注損傷

[中圖分類號] R614[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2014）15-0010-04

Protective effects of fentanyl combined with propofol on pulmonary ischemia reperfusion injury in rats

WEN Wen GUO Guangwei HUANG Zhigang SUN Guodong LI Xiaohui

Department of Cardiothoracic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Objective To study the expression of nuclear factor-κB(NF-κB) in the lung and plasma separately and explore the possible mechanisms of fentanyl combine with propofol on lung ischemia-reperfusion injury of rats. Methods The 40 Wistar male rats weighing 220 ～ 270 g were divided randomly into five groups which were pretreated differently. The values of NF-κB in rats lung was detected by using immunohistochemical method, the lung tissue observed in vitro and under the microscope after HE staining， the rats arterial oxygen pressure and the lung tissue W / D ratio were measured in each group. Results Compared with the I / R group, the F group, the P group, and the F+P group all followed the same trend: the NF-κB expression levels were obviously lower (P＜0.01), the values of PaO2 were obviously higher(P＜0.01), and the W / D ratios were lower(P＜0.01). Conclusion Fentanyl combined with propofol can significantly reduce lung ischemia-reperfusion injury, it may be that fentanyl combined with propofol can reduce the level of NF-κB in rats lung.

[Key words] Fentanyl; Propofol ; Nuclear factor-κB ; Ischemia reperfusion injury缺血再灌注常發生在組織器官缺血后恢復血供，如休克時微循環的疏通、冠狀動脈痙攣的緩解、溶栓療法等血管再通術后、心臟驟停后心腦肺復蘇、 PTCA、動脈搭橋術、心臟外科體外循環術、器官移植及斷肢再植等，對心、腦、腸、肝的缺血再灌注損傷的研究較多，而肺缺血再灌注損傷相對較少。有報道稱，NF-κB 的激活能調節多種炎性因子基因的表達，與免疫反應有關[1]。隨著對芬太尼及丙泊酚研究的深入發現，芬太尼及丙泊酚可抑制NF-κB的過度產生，從而起到減輕組織器官缺血/再灌注損傷的作用。然而目前關于芬太尼以及丙泊酚二者單獨使用對急性肺缺血再灌注損傷的保護效果如何以及聯合應用在急性肺缺血再灌注損傷中是否優于單純使用芬太尼或丙泊酚尚不清楚。本文通過檢測肺組織中NF-κB表達水平，及芬太尼聯合丙泊酚對NF-κB表達水平的影響，旨在探討芬太尼及丙泊酚在肺缺血再灌注損傷中對肺組織保護的作用機制。

1材料與方法

1.1主要試劑

丙泊酚注射液（北京費森尤斯卡比醫藥有限公司），芬太尼注射液（宜昌人福藥業有限公司），兔 NF-κBp65抗體（武漢博士德生物工程有限公司），SA1022-兔IgG型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2實驗分組與模型建造

1.2.1 分組 8周齡健康雄性Wistar大鼠40只，體重220～270 g，隨機分為5組，每組8只。

1.2.2 造模 改良的Eppinger法建造在體大鼠肺缺血再灌注引起的急性肺損傷模型。25%烏拉坦按4 mL/kg腹腔注射麻醉，頸部游離右頸動脈及氣管后氣管插管，接呼吸機，通氣頻率為75次/min，潮氣量為10 mL，吸呼比為1∶2，機械通氣10min待動物情況穩定后，左側第5肋間進胸，創面止血徹底后固定開胸器，用無創血管夾夾閉左肺門。夾閉肺門前，應仔細游離左肺門并將左下肺韌帶離斷，尾緣靜脈注射50 U肝素 5min。關胸30 min后開放血管夾行缺血后復流60min。缺血再灌注組(I/R組)僅阻斷左肺門30 min；芬太尼治療組（F組）阻斷左肺門前給予20 μg/kg芬太尼，之后阻斷30min；丙泊酚治療組（P組）阻斷左肺門前給予50mg/kg丙泊酚，之后阻斷肺門30 min；芬太尼聯合丙泊酚組（F+P組），給予20 μg/kg芬太尼以及50mg/kg丙泊酚后阻斷左肺門30 min。前四組阻斷肺門并執行相關操作后關胸。假手術組（S組）僅開放胸腔一段時間（與其余四組時間相同）。再灌注完畢后，經頸動脈取血0.5 mL進行動脈血氣分析，頸椎脫臼處死大鼠后取左肺下葉進行肺濕/干（wet/dry，W/D）值檢測，取左肺上葉石蠟包埋并切片，每只大鼠切片兩張，分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色病理學觀察以及免疫組化檢測。

1.3 檢測指標

1.3.1肺組織濕/干（wet/dry，W/D）值的計算測定并記錄處死后大鼠的左肺下半葉肺組織濕重（W），置于60℃恒溫烘箱中烘烤 48 h至恒重，測定并記錄干重（D），求得二者比值即為濕/干重（W/D）值。

1.3.2動脈血氣分析各組大鼠處死前經頸動脈取動脈血0.5 mL，測定PaO2 值。通過PaO2值變化反應肺氣體交換情況，進一步判斷肺缺血再灌注損傷情況，是反應肺功能的重要指標。

1.3.3肺組織病理形態觀察大鼠左肺上葉HE染色，取大鼠左肺上葉放入4% 甲醛中固定、石蠟包埋、每只大鼠切片兩張，分別進行HE染色病理學分析及免疫組化檢測。將肺組織HE染色后，光鏡下觀察肺組織的病理形態學改變。

1.3.4肺組織中核因子-κB表達水平的檢測免疫組化 SABC法測定大鼠左上葉肺組織 NF-κB表達水平的變化。按說明書操作，取石蠟片按程序脫蠟至水，滅活內源性酶、熱抗原修復、BSA 封閉、滴加的一抗陰性對照以PBS為一抗、滴加二抗（1∶100稀釋生物素化山羊抗兔 IgG）、滴加 SABC后，加 DAB試劑盒（AR1022試劑盒中 A、B、C 試劑各 1 滴），室溫顯色。蘇木素復染，脫水、透明、干燥、樹脂封片。以胞漿及胞核出現棕黃色顆粒為陽性標準，鏡下放大 400倍，隨機選取不重疊的10個視野，使用圖像分析系統計算出每個視野陽性細胞數占總細胞數的百分比并取平均值。

1.4統計學處理

所有數據采用SPSS17.0統計學分析軟件進行處理，測定結果用均數±標準差（x±s）表示，均數之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t方法檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1大鼠肺組織濕/干質量（wet/dry mass，W/D）值的計算

I/R組水腫較明顯，與I/R組相比，S組、F組、P組和F+P組的W/D值明顯下降，差異有統計學意義 （P<0.01）；單藥組F組與P組W/D值比較無顯著差異 （P>0.05）；聯合用藥組F+P組與單藥組F組或P組分別比較W/D值明顯下降，差異有統計學意義 （P<0.01）,見表1。

2.2各組大鼠PaO2的變化情況

I/R組PaO2值明顯降低，與I/R組相比，S組、F組、P組和 F+P組的PaO2值明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）；F組與P組PaO2值比較無顯著差異（P>0.05）；F組或P組與F+P組分別比較，PaO2值明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。

2.3大鼠肺組織病理學觀察

S組大鼠肺組織病理學改變不明顯；與S組形成對比，I/R組大鼠肺組織間質毛細血管出現淤血、擴張現象，肺泡壁增厚，肺間質水腫，肺間質及肺泡內大量的紅細胞和液體以及中性粒細胞浸潤滲出，呈現出嚴重病理改變；F組和P組大鼠肺間質及肺泡滲出、炎性細胞浸潤程度較I/R組輕。聯合用藥組F+P組大鼠肺組織改變較單藥組情況更好。

2.4 NF-κB在肺組織免疫組化處理之后表達分布以及表達水平

S組（圖1）可見淺棕黃色染色弱陰性顆粒，極少量分布于炎性細胞及肺泡上皮的胞漿中，胞核中極少有陽性表達；I/R組（圖2）不僅大量炎性細胞、肺泡上皮細胞的胞漿中分布有較強棕黃色染色顆粒，細胞核中也出現了較強棕黃色顆粒；F組（圖3）和P組（ 圖4）炎性細胞以及肺泡上皮細胞的胞漿及胞核中較多的分布有棕黃色染色顆粒；F+P組（圖5）棕黃色染色顆粒較F組及P組少的分布于炎性細胞以及肺泡上皮細胞的胞漿之中。

圖1 S組再灌注60 min NF-κB免疫組化染色（×100） 染色顆粒分布于細胞漿，與I/R組比較NF-κB的表達量很少

圖2 I/R組再灌注60min NF-κB免疫組化染色（×100） 染色顆粒分布于細胞漿，NF-κB大量表達

圖3 F組再灌注60min NF-κB免疫組化染色（×100） 染色顆粒分布于細胞漿，與I/R組比較NF-κB的表達量減少

圖4 P組再灌注60min NF-κB免疫組化染色（×100） 棕黃色染色顆粒分布于細胞漿，與I/R組比較NF-κB的表達量減少

圖5 P+F組再灌注60min NF-κB免疫組化染色（×100） 棕黃色染色顆粒分布于細胞漿，與I/R組比較NF-κB的表達量明顯減少

肺缺血再灌注后，與I/R組比較，S組、F組、P組以及F+P組NF-κB表達水平明顯下降 ，差異有統計學意義（P<0.01）；F組與P組比較，NF-κB表達水平無明顯差異（P>0.05）；F+P組與F組、P組分別進行比較，NF-κB表達水平明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）,見表1。

表1 各組別肺組織W/D值、Pa02值（mmHg）、NF-κB變化

（x±s，n=8,％）

注：I/R組W/D值、PaO2值、NF-κB變化與其余各組比較差異有統計學意義（P＜0.01）; F組與P組比較差異無統計學意義（P＞0.05）

3 討論

核因子-κB（NF-κB）是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κB序列特異結合的、從免疫B細胞中發現的轉錄調節因子，具有廣泛的生物學活性，活化后能夠參與許多基因表達的調控，在基因水平對多種炎癥因子的激活發揮著重要作用。典型的NF-κB是由p65和p50單體構成的異源性二聚體。 NF-κB含有一段負責與DNA結合、二聚體化和核轉位，同時也是抑制蛋白IκB（inhibitor of NF-kappa B）的結合位點的區域，由300個氨基酸構成，稱為Rel同源區。在未受到胞外因素刺激時， NF-κB與IκB結合并以結合型NF-κB的非活性異寡聚體的狀態存在于細胞核外。組織細胞外多種損傷因素，如IL-1、TNF-α、氧自由基、內毒素、病毒蛋白、生長因子以及缺血再灌注損傷、氣壓傷、嚴重創傷等因素的刺激可通過信號傳導引起IκB降解，從而導致NF-κB-IκB復合物解體，活化的NF-κB進入核內，并與DNA鏈上特定的κB序列特異性結合，啟動和調節眾多與免疫和炎癥反應有關的基因轉錄[2]，加速有關基因編碼的趨化因子、黏附分子、轉錄因子、炎癥相關的凋亡抑制因子以及酶和抑制劑等的表達[3]。NF-κB通過調節多種細胞因子轉錄，對細胞因子之間產生廣泛作用[4]，從而導致細胞產生一系列正反饋級聯放大的炎癥損傷反應,從而導致肺缺血再灌注損傷[5]。因此，檢測大鼠肺組織中NF-κB的表達水平，可能反映肺損傷炎癥反應強弱程度以及評價藥物使用干預的治療效果。

芬太尼作為阿片受體激動劑，作用于邊緣系統與情緒有關的阿片類受體，有消除緊張和焦慮的作用。由于具有鎮痛效價高、降低心肌氧耗及無組胺釋放的優勢，目前已廣泛應用于手術前誘導、術中維持以及術后的鎮靜與鎮痛，已基本取代嗎啡。近來發現芬太尼預處理缺血再灌注器官對NF-κB表達能有降低的作用。芬太尼是一種與嗎啡結構類似的同類鎮痛藥，結合嗎啡對NF-κB的免疫調節效應通過阿片類受體實現[6]，引起與缺血預適應類似的作用[7]，因此推斷芬太尼也可能通過影響NF-κB的活性而發揮抑制缺血再灌注損傷的作用。劉志恒[8]等通過使用芬太尼處理人T 淋巴瘤細胞系Jurkat 細胞，檢測出Jurkat 細胞中NF-κB的表達有所降低。