MSI2在胰腺癌中的表達及其臨床意義

高志剛 郭克建 宋少偉

胰腺癌惡性程度高，預后差，病死率居所有惡性腫瘤的第4位[1]。近年來，盡管診斷技術和治療手段不斷提高，但其早期診斷仍然困難，手術切除率低，5年生存率始終低于5%[1]。Musashi2(MSI2)屬于進化保守的RNA結合蛋白Musashi家族成員之一，它位于17號染色體，是干細胞或祖細胞的標志物之一。文獻報道[2-3]，MSI2參與急性粒細胞白血病的發生、發展，是該病的治療靶點和預后標志物。He等[4]報道，MSI2與上皮間質轉化(EMT)有關，并且可作為肝癌預后潛在的生物學標記物，有助于肝癌術后的診斷和治療。Emadi-Baygi等[5]報道，MSI2與胃癌的分級有關。但其在胰腺癌中的研究尚未見報道。本研究檢測胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)中MSI2的表達，并探討其臨床意義。

材料和方法

一、材料

收集 2005年1月至2013年12月中國醫科大學附屬第一醫院胰腺外科收治的61例具有完整臨床資料并經病理證實的PDAC手術切除標本，以配對的癌旁組織為對照。其中51例有完整的隨訪資料。另取10例新鮮的PDAC及配對的癌旁組織標本，置液氮中冷凍保存。兔抗人MSI2單抗購自美國ABCAM公司。SP法免疫組化試劑盒、DAB顯色液購自福州邁新公司。蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、上樣緩沖液、BCA定量及ECL發光試劑盒均購自上海碧云天生物公司。RNA分離試劑 Trizol、逆轉錄試劑盒(DRR037S)、SYBR GreenⅡ實時熒光定量PCR 試劑盒等均購自日本Takara公司。本研究經中國醫科大學附屬第一醫院道德倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、MSI2蛋白檢測

取10%甲醛固定的組織標本,石蠟包埋、切片、常規行免疫組化SP法檢測MSI2蛋白的表達。光學顯微鏡下觀察結果。每張切片在高倍顯微鏡下隨機選取 5個視野，參考文獻[6]的標準進行評分。陽性細胞占總細胞數的1%～24% 計1分，25%～49%計2分，50%～74%計3分，≥75%計4分；無著色0分，淺黃色1分，黃色或深黃色2分，褐色或棕褐色3分。兩項評分相乘，≥4分為高表達。

另取液氮保存的新鮮組織，應用蛋白裂解液制備勻漿，經BCA定量蛋白濃度后常規行蛋白質印跡法檢測MSI2蛋白的表達。以GAPDH為內參。最后ECL發光并以凝膠顯像儀 (MF-chemibis 3.2 DNR，以色列)顯像，采用quantity one軟件計算條帶面積和密度的灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白的相對表達量。

三、MSI2 mRNA檢測

采用Trizol提取并純化新鮮組織總RNA，采用Takara逆轉錄和擴增試劑盒行逆轉錄和擴增，按說明書操作。MSI2上游引物5′-GCCCTTTGTTTAGGTGATGTC-3′，下游引物5′-CAGCAGATTCGTGAGATGATG-3′；GAPDH上游引物5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，下游引物5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。 引物均由Takara公司設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實時PCR反應體系：TaKaRa 2×SYBRR Premix Ex TaqTM12.5 μl，100 nmol/L上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，H2O 8.5 μl；反應條件：95℃ 5 min，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個循環。所有反應均設復孔，并以DEPC水代替模板cDNA作為陰性對照。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，采用公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。ΔΔCt =(ΔCt癌組織目的基因-ΔCt癌組織內參基因)-(ΔCt癌旁組織目的基因-ΔCt癌旁組織內參基因)。以癌旁組織的表達量為1，計算癌組織的表達倍數。

四、統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。配對的癌與癌旁組織蛋白和mRNA表達比較采用配對t檢驗。MSI2蛋白表達與臨床病理參數的關系采用χ2檢驗。Kaplan-Meier單因素分析計算累積生存率，生存期差異行Log-Rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、PDAC組織和癌旁組織MSI2蛋白表達

PDAC組織MSI2主要表達在癌細胞的胞質及胞核內(圖1a)，61例PDAC中39例(63.9%)MSI2高表達；癌旁正常胰腺組織MSI2主要表達于胰島細胞，胰腺導管上皮細胞呈弱表達，腺泡細胞未見表達(圖1b)，25例(41.0%)MSI2高表達。癌組織MSI2的高表達率明顯高于相應癌旁組織，差異有統計學意義(t=2.809，P=0.007)。

圖1 PDAC組織(1a)及癌旁正常胰腺組織(1b)MSI2的表達(免疫組化 ×200)

蛋白質印跡法結果顯示癌組織MSI2蛋白的表達量為0.748±0.195，癌旁組織為0.420±0.171，癌組織的表達顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(t=3.689，P=0.005，圖2)

圖2 癌組織(T)及配對癌旁組織(N)MSI2蛋白的表達

二、PADC組織及配對癌旁組織MSI2 mRNA的表達

10例PADC組織MSI2 mRNA的表達量為癌旁正常胰腺組織的(2.507±2.981)倍，差異具有統計學意義(t=2.660，P=0.026，圖3)。

圖3 10例PDAC組織及配對癌旁組織MSI2 mRNA的表達量

三、MSI2蛋白表達與PDAC臨床病理參數的關系

癌組織MSI2蛋白表達僅與腫瘤大小呈正相關(χ2=5.096，P=0.024)，而與其他參數均無明顯相關性(表1)。

表1 癌組織MSI2表達與腫瘤臨床病理參數的關系(例數)

四、MSI2蛋白表達與胰腺癌患者術后生存期的關系

51例獲取隨訪的PDAC患者中，MSI2高表達30例，術后中位生存期為321 d，低表達21例，術后中位生存期為730 d，高表達者的生存期顯著短于低表達著，差異有統計學意義(χ2=6.706，P=0.010，圖4)。

討 論

胰腺癌發病率逐年上升，早期診斷困難，手術切除率低，對化療及放療欠敏感，尋找與胰腺癌相關的分子標志物具有重要的臨床意義。Kharas等[3]通過小鼠的體內實驗發現MSI2高表達可增加造血干細胞的增殖，并且與癌基因BCR-ABL1共同參與了慢性粒細胞白血病的侵襲進展,證實了MSI2可作為急性白血病新的預后標志物和治療靶點。Mu等[7]檢測116例B細胞急性淋巴細胞白血病患者的MSI2 mRNA的表達，結果表明B-ALL參與該病的發生發展，是其獨立的危險因素。He等[4]檢測149例肝癌癌及癌旁組織和40例正常肝組織的MSI2基因表達，結果顯示癌組織明顯高表達，而癌旁及正常肝組織罕有表達。文獻[3,8-14]還報道，急性髓系白血病、肝癌、肺癌、結腸癌及腦膜癌組織的MSI2基因均明顯高表達。然而，Emadi-Baygi等[5]報道，胃癌與癌旁組織的MSI2基因表達差異無統計學意義。本研究結果顯示，與癌旁正常胰腺組織比較，MSI2在PDAC中表達亦明顯上調。

圖4 PADC患者的生存曲線

何璐等[11]報道，MSI2高表達的肝癌患者的腫瘤侵襲性強，復發風險高,可能發揮潛在的癌基因功能，促進腫瘤的侵襲轉移。此外，MSI2與上皮間質轉化有關，可作為肝癌預后潛在的生物學標記物，有助于肝癌術后的診斷和治療[4]。王婭菲等[13]發現，MSI2 在低分化結腸腺癌中高表達。低分化癌一般具有較高的惡性程度和較差的預后，提示其可能是結腸腺癌患者預后不佳的預測指標。國外文獻報道，MSI2高表達的急性白血病患者預后不良[3，7,9]。本研究結果亦顯示，胰腺癌組織MSI2表達與腫瘤大小呈正相關，高表達MSI2的PDAC患者預后差。這些結果均提示MSI2可以作為評估多種腫瘤患者預后的一個指標。

參 考 文 獻

[1] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2009[J].CA Cancer J Clin, 2009,59(4):225-249.

[2] Thol F, Winschel C, Sonntag AK, et al. Prognostic significance of expression levels of stem cell regulators MSI2 and NUMB in acute myeloid leukemia[J].Ann Hematol, 2013,92(3):315-323.

[3] Kharas MG,Lengner CJ,Al-Shahrour F,et al.Musashi-2 regulates normal hematopoiesis and promotes aggressive myeloid leukemia[J]. Nat Med, 2010,16(8): 903-908.

[4] He L, Zhou X, Qu C, et al. Musashi2 predicts poor prognosis and invasion in hepatocellular carcinoma by driving epithelial-mesenchymal transition[J]. J Cell Mol Med, 2014,18(1):49-58.

[5] Emadi-Baygi M, Nikpour P, Mohammad-Hashem F,et al. MSI2 expression is decreased in grade Ⅱ of gastric carcinoma[J]. Pathol Res Pract, 2013,209(11): 689-691.

[6] Supuran CT. Carbonic anhydrase inhibitors and activators for novel therapeutic applications[J]. Future Med Chem, 2011,3(9):1165-1180.

[7] Mu Q, Wang Y, Chen B, et al. High expression of Musashi-2 indicates poor prognosis in adult B-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res, 2013,37(8):922-927.

[8] Ito T, Kwon HY, Zimdahl B, et al. Regulation of myeloid leukaemia by the cell-fate determinant Musashi[J]. Nature, 2010,466(7307):765-768.

[9] Griner LN,Reuther GW.Aggressive myeloid leukemia formation is directed by the Musashi2/Numb pathway[J]. Cancer Biol Ther, 2010,10(10):979-982.

[10] 鄒秀平，黃偉，劉珊珊，等.MSI2和NUMB在白血病中的表達和分析[J].臨床血液學雜志,2013,26(5):319-321.

[11] 何璐，周新科，洪健.肝細胞癌中Musashi2的表達及意義[J].廣東醫學, 2013,34(20):3152-3154.

[12] 莫碧文,李勞冬,于會娜,等.Musashi2在肺癌中的表達及其臨床意義[J].安徽醫科大學學報,2013, 48(12):1480-1483.

[13] 王婭菲,林中,盧青,等.Musashi2、CD133在結腸腺癌中的表達[J].天津醫藥, 2013,41(12):1153-1155.

[14] Cox JL, Wilder PJ, Gilmore JM,et al,The SOX2-interactome in brain cancer cells identifies the requirement of MSI2 and USP9 X for the growth of brain tum or cells[J]. PLoS One, 2013,8(5):e62857.