硫氧還蛋白-2在急性壞死性胰腺炎大鼠肺的表達及意義

趙暉 鐘衛一 韋惠琴 黃滟添

硫氧還蛋白-2(thioredoxin-2, Trx-2)是存在于細胞線粒體的一種氧化還原蛋白，研究顯示Trx-2在阻止線粒體氧化應激方面較Trx-1更具重要作用[1]。為此，本研究檢測Trx-2在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺的表達，探討Trx-2在對抗肺氧化應激方面的作用。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：健康雄性SD大鼠48只,清潔級,體質量200～250 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。所有大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。按完全隨機法分成ANP組和對照組，每組各24只。采用腹腔注射6%左旋精氨酸(Sigma公司)25 ml/kg體質量、每次間隔1 h、共3次的方法制備ANP模型。對照組大鼠則腹腔注射等容積生理鹽水。術后6 、12 、24 h分別處死8只大鼠，留取動脈血、胰腺和肺組織標本待測。

2．胰腺和肺組織病理學檢查：胰腺和肺組織常規固定、石蠟包埋、切片及HE染色。光鏡下觀察大鼠胰腺病理改變,參考Kusske等[2]的標準進行評分。

3．血清谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測定：GSH、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按說明書操作。

4．Trx-2表達檢測：采用Elivison二步法檢測肺組織Trx-2表達。兔抗鼠多抗購自北京生物合成及生物技術公司，工作濃度1∶200；生物素化羊抗兔二抗來自即用型免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知表達Trx-2的乳腺癌組織作為陽性對照。應用Leica圖像分析系統進行定量灰度掃描，求出給定面積內的灰度值。染色愈深、灰度值愈小，則表示蛋白表達愈強。

二、結果

1．胰腺及肺組織病理變化：對照組大鼠胰腺肉眼觀無明顯變化；鏡下見胰腺腺泡結構完整，腺小葉清晰，偶見水腫或少量炎性細胞浸潤。ANP組大鼠胰腺外觀呈灰白或暗紫色，腹腔內有淡黃色或血性腹水，可見部分腹腔臟器粘連、脂肪皂化；鏡下見胰腺腺泡水腫，炎性細胞浸潤，組織壞死出血，腺小葉結構消失，偶見灶狀或大片凝固性壞死，并隨時間延長而加重(表1)。

對照組大鼠肺臟肉眼觀無明顯變化；鏡下見肺組織結構完整，偶見水腫或少量炎性細胞浸潤。ANP組大鼠鏡下見肺泡出血、水腫，間質出血、水腫，炎性細胞浸潤，毛細血管淤血，甚至出現灶性或片狀肺不張，并隨時間延長而加重(表1)。

2．血清GSH、MDA水平的變化：ANP組大鼠血清GSH水平隨時間延長而逐漸下降，各時點均較對照組顯著降低，差異有統計學意義；ANP組血清MDA水平隨時間延長而逐漸上升，各時點均較對照組顯著升高，差異有統計學意義(表1)。

表1 兩組大鼠各指標的比較

3．肺組織Trx-2表達的變化：ANP組6、12 h的肺組織Trx-2表達強度與對照組差異無統計學意義，24 h點表達強度顯著增高，與對照組的差異有統計學意義(表1、圖1) 。

圖1 對照組(1a)、ANP組(1b) 24 h點肺組織Trx-2表達(免疫組化×100)

討論硫氧還蛋白是一個廣泛分布的氧化還原蛋白，通過二硫化物活性中心可逆地催化許多氧化還原反應，參與機體多種生物學活動，目前發現的Trx有Trx-1、Trx-2、Trx-14和Trx-80。研究表明，Trx-1和Trx-2過量表達協同阻止多種炎性因子(TNF、ROS、ASK1)誘導的細胞死亡[3]。最近研究揭示，線粒體在細胞凋亡信號轉導中發揮關鍵作用，而Trx-2在參與線粒體介導的凋亡途徑、阻止線粒體膜的去極化、維持膜電位等方面較Trx-1更有效[1]。它們對氧化應激保護作用的差異可能是與其表達部位不同有關。Trx-2在線粒體中表達，而Trx-1在細胞質中表達，因此，Trx-2可以直接阻止線粒體膜的去極化[4]。Umasuthan等[5]研究表明，Trx-2是一種針對抗菌反應的強效抗氧化劑。

與Trx-1比較，Trx-2的結構存在一個額外的N-末端結構域，它包含兩個高度保守的CXXC( Cys Xaa Xaa Cys)氨基酸序列結構，這兩個CXXC結構緊密協調一個鋅原子，組成鋅中心，氧化時鋅被釋放，通過釋放鋅引發主要構象變化，發揮氧化還原開關的作用[6]。Trx-2鋅結合蛋白的特點是鋅極端的親和力，它遠遠高于已報道的其他鋅結合蛋白的親和常數，因此，這種鋅結合蛋白顯得更加穩定[7]。Ritz等[8]研究顯示，體內氧化應激早期時，所有Trx-2的半胱氨酸處于還原狀態，并不反映活性氧的存在。他們認為Trx-2功能可相當于Trx-1 ，在氧化應激條件下可能作為一個備份系統發揮作用。

本課題組先前的研究結果顯示，在ANP早期肺組織Trx-1表達即顯著升高[9]。本結果顯示Trx-2在肺組織的表達在早期并不升高，而在晚期隨著氧化應激反應的加重(表現為血GSH持續降低，MDA持續升高)時才顯著升高，與Ritz等[8]的結果相一致，表明Trx-2可能作為一個備用系統參與肺的氧化應激反應。Trx-2在氧化應激的早期表達不高，除與Trx-2鋅結合蛋白極端親和力的特征外，還可能與Trx-1表達增高,減少氧化應激有關[10]。

參 考 文 獻

[1] Sugano E, Murayama N, Takahashi M, et al. Essential role of thioredoxin 2 in mitigating oxidative stress in retinal epithelial cells[J].J Ophthalmol,2013,185825.

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[3] Tournier C, Hess P, Yang DD, et al. Requirement of JNK for stress-induced activation of the cytochrome c-mediated death pathway[J]. Science, 2000,288(5467): 870-874.

[4] Sugano E, Isago H, Murayama N，et al.Different anti-oxidant effects of thioredoxin 1 and thioredoxin 2 in retinal epithelial cells[J].Cell Struct Funct, 2013,38(1):81-88.

[5] Umasuthan N, Revathy KS, Lee Y, et al.Mitochondrial thioredoxin-2 from Manila clam (Ruditapes philippinarum) is a potent antioxidant enzyme involved in antibacterial response[J]. Fish Shellfish Immunol, 2012,32(4):513-523.

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[8] Ritz D, Patel H, Doan B, et al. Thioredoxin 2 is involved in the oxidative stress response in Escherichia coli[J].J Biol Chem, 2000,275(4):2505-512.

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[10] Zhang H, Du Y, Zhang X, et al. Glutaredoxin 2 Reduces Both Thioredoxin 2 and Thioredoxin 1 and Protects Cells from Apoptosis Induced by Auranofin and 4-Hydroxynonenal[J]. Antioxid Redox Signal, 2014,21(5):669-681.