血液制品用切向流超濾系統(tǒng)清洗消毒方法的有效性研究

張 良，王 炳，馮仁平，李 劍

(1.四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室，四川成都 610041;2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610041)

0 引 言

切向流(tangential flow filtration，TFF)超濾被廣泛應(yīng)用于血液制品生產(chǎn)過程中，洗脫乙醇，純化蛋白和濃縮配制產(chǎn)品，是目前血液制品生產(chǎn)常用的一種分離提純方法.超濾系統(tǒng)的超濾膜在處理蛋白料液后，由于分離物質(zhì)及其他雜質(zhì)會在膜表面或膜孔中逐漸積聚，不但會造成膜的污染和堵塞，也可能會滋生微生物，而污染后的膜通量會下降，清洗難度大，膜使用壽命縮短，嚴(yán)重影響超濾系統(tǒng)的工作效率［1］.超濾系統(tǒng)的有效清洗不僅能有效控制微生物的污染，而且能延長超濾膜的使用壽命，保證產(chǎn)品質(zhì)量.目前，血液制品生產(chǎn)使用的TFF 超濾系統(tǒng)中的超濾膜使用最多的是聚醚砜材質(zhì)膜堆，而氫氧化鈉(NaOH)與氯化鈉(NaOH)是用于此類材質(zhì)膜堆的常用清洗劑之一，同時，由于它們還能滅活大多數(shù)的病毒、細(xì)菌、酵母及真菌，也常被作為消毒劑使用［2］.

通常，影響超濾系統(tǒng)清洗效果的主要因素有:清洗劑的濃度、清洗時間和清洗劑溫度.超濾系統(tǒng)的清洗過程主要包括沖洗、清洗、除熱原、消毒等.實際生產(chǎn)中的清洗方法主要分為使用前清洗流程和使用后清洗流程.使用前清洗流程主要是去除超濾系統(tǒng)內(nèi)貯存的貯存液，保證清洗后的系統(tǒng)能投入生產(chǎn)使用;使用后清洗流程主要是去除超濾系統(tǒng)中的污染物，這些污染物包括超濾的料液的主要成分，人血白蛋白與其他雜蛋白，以及可能存在的微生物.使用前清洗及使用后清洗流程如圖1 所示.本研究主要討論常用清洗劑對超濾系統(tǒng)清洗的有效性.

圖1 超濾系統(tǒng)清洗流程示意圖

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用的材料包括:NaOH(分析純)，由湖南爾康制藥股份有限公司生產(chǎn);NaCl(分析純)，由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn).

1.2 儀 器

實驗所用的儀器包括:超濾器，美國密理博(MILLIPORE)公司，PBGC/P28010A25 材質(zhì)，截留分子量10 KD，膜有效面積5 m2，進(jìn)液壓力≤0.4 MPa，出液壓力≤0.2 MPa，濾過端壓力為0 MPa，透膜壓力(TMP)0.1 ～0.3 MPa，初始水通量(NWP)9.79 L/min·5 m2;Sievers 900 總有機(jī)碳分析儀，通用電氣分析儀器公司;METTLER TOLEDO PH 儀、METTLER TOLEDO 電導(dǎo)儀，梅特勒—托利多國際股份有限公司;Millipore Integritest 4 自動完整性測試儀、MILLIPORE Microfil 微生物限度檢查儀，美國密理博(MILLIPORE)公司.

2 檢測與標(biāo)準(zhǔn)

2.1 檢測項目

2.1.1 無菌檢測.

用無菌取樣瓶取樣200 mL，按照《藥典》中微生物限度檢查法［3］中的薄膜過濾法檢測微生物限度.

2.1.2 內(nèi)毒素檢測.

采用干烤膜制瓶取樣10 mL，用鱟試劑法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素.

2.1.3 總有機(jī)碳(Total organic carbon，TOC)檢測.

用TOC 專用取樣瓶取樣20 mL，進(jìn)行TOC 檢測.

2.1.4 檢測電導(dǎo)率.

使用理化取樣瓶取樣檢測電導(dǎo)率.檢測結(jié)果=送樣檢測值－背景值，新鮮注射用水的TOC 和電導(dǎo)率作為背景值.

2.1.5 系統(tǒng)水通量及膜包完整性測試.

取樣完成后進(jìn)行超濾系統(tǒng)水通量測試，超濾系統(tǒng)初始水通量(NWP)為9.79 L/min·5 m2，當(dāng)膜堆使用了一次之后，所測出的水通量不應(yīng)低于最初標(biāo)準(zhǔn)的60% ～80%，即使用后水通量測試最低應(yīng)不低于5.87 L/min·5 m2.水通量測試完成后進(jìn)行超濾系統(tǒng)超濾膜包的完整性測試.

2.2 檢測標(biāo)準(zhǔn)

超濾系統(tǒng)清洗后，其細(xì)菌內(nèi)毒素和微生物限度符合《藥典》中注射用水標(biāo)準(zhǔn)［3］.具體而言:細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)應(yīng)不高于10 CFU/100 mL;細(xì)菌內(nèi)毒素檢測應(yīng)＜0.25 EU/mL;根據(jù)《PIC/S-GMP 指南》第二部分(原料藥基本要求)和PAD 第29 號技術(shù)報告《清潔驗證草案》規(guī)定:計算得出的TOC 殘留可接受標(biāo)準(zhǔn)＜969 ppb;電導(dǎo)率≤1.3 μS/cm(25℃);水通量不低于初始水通量的60%.

3 方法與內(nèi)容

實驗中，模擬實際生產(chǎn)中超濾系統(tǒng)超濾人血白蛋白料液的過程.使用前與使用后清洗過程中超濾膜堆進(jìn)/回/出壓力控制為0.2 ±0.01/0.08 ±0.01/0 MPa.采用與實際生產(chǎn)相同的使用后清洗流程清洗，調(diào)整清洗參數(shù)，優(yōu)化使用后清洗流程效果.使用后清洗流程完成后，存放168 h.采用與實際生產(chǎn)相同的使用前清洗流程，調(diào)整清洗液體積觀察清洗效果.清洗流程完成后，使用注射用水循環(huán)超濾系統(tǒng)，循環(huán)5 min 后，在系統(tǒng)回流端取樣檢測微生物限度、細(xì)菌內(nèi)毒素、TOC 和電導(dǎo)率，并檢測超濾系統(tǒng)水通量和系統(tǒng)完整性.實驗重復(fù)3 次，其中微生物限度、TOC 和水通量，均為3 次統(tǒng)計結(jié)果的平均值［4－5］.

3.1 比較0.9% NaCl溶液和注射用水的清洗效果

1)超濾系統(tǒng)模擬實際生產(chǎn)超濾過程后，使用單位膜量60 L/m2(總量300 L，膜總面積5 m2，單位膜量60 L/m2)，溫度為20 ±2 ℃的0.9% NaCl 清洗超濾系統(tǒng).在清洗液使用量分別為10、20、30、40、50 L/m2時取樣，檢測微生物限度、細(xì)菌內(nèi)毒素、TOC 值和水通量.

2)超濾系統(tǒng)模擬實際生產(chǎn)超濾過程后，使用單位膜量60 L/m2，溫度為20 ±2 ℃的注射用水清洗超濾器.在清洗液使用量分別為10、20、30、40、50 L/m2時取樣，檢測微生物限度、細(xì)菌內(nèi)毒素、TOC 值和水通量.

3.2 比較不同體積的0.5 mol/L NaOH清洗消毒效果

繼“3.1”項清洗后，先使用20 L/m2注射用水清洗，然后使用0.5 mol/L NaOH 溶液進(jìn)行循環(huán).溫度為22±2 ℃，使用不同的循環(huán)體積，5、10、15、20、25 L，并在不同的循環(huán)時間點，15、30、45、60 min 時，取樣，檢測微生物限度、細(xì)菌內(nèi)毒素、TOC 值和水通量.

3.3 0.1mol/L NaOH進(jìn)行循環(huán)貯存及注射用水進(jìn)行前清洗效果

使用10 L，溫度為20±2 ℃的0.1 mol/L NaOH 溶液循環(huán)5 min，關(guān)閉系統(tǒng)閥門貯存168 h 后，按前清洗流程對超濾系統(tǒng)進(jìn)行清洗.注射用水的清洗體積分布為100、125、150、175、200 L.清洗完成后取樣，檢測微生物限度，細(xì)菌內(nèi)毒素、TOC 及電導(dǎo)率，并進(jìn)行水通量測試和系統(tǒng)完整性測試.

4 結(jié)果與討論

4.1 0.9% NaCl 溶液和注射用水清洗的有效性

按“3.1”項內(nèi)容進(jìn)行0.9% NaCl 溶液和注射用水的清洗效果的比較實驗，其對TOC、水通量和微生物限度的影響如圖2 ～7 所示.

圖2 0.9% NaCl 溶液和注射用水清洗后TOC 檢測結(jié)果

圖3 0.9% NaCl 溶液和注射用水清洗后水通量檢測結(jié)果

圖4 0.9% NaCl 溶液加注射用水清洗后的TOC 檢測結(jié)果

圖5 0.9% NaCl 溶液加注射用水清洗后水通量檢測結(jié)果

圖6 0.9% NaCl 溶液和注射用水清洗后微生物限度檢測結(jié)果

圖7 0.9% NaCl 溶液加注射用水清洗后微生物限度檢測結(jié)果

由圖2、3 可知，0.9% NaCl 溶液清洗量到達(dá)20 L/m2時，TOC 值由10 L/m2時的1 500 ppb 降到741 ppb，TOC 變化最快，清洗量為40 L/m2時，TOC 值下降至560 ppb，達(dá)到了TOC 殘留可接受標(biāo)準(zhǔn)，并與相同量注射用水清洗的TOC 重合，清洗量在40 L/m2以后趨于平穩(wěn).0.9% NaCl 溶液清洗量達(dá)到20 L/m2后，水通量恢復(fù)比較平穩(wěn)，達(dá)到6.56 L/min·5 m2，恢復(fù)率為67.0%，注射用水溶液清洗量達(dá)到20 L/m2后，水通量恢復(fù)值為4.97 L/min·5 m2，恢復(fù)率為50.8%.0.9% NaCl 溶液清洗后水通量恢復(fù)好于相同量注射用水清洗后的水通量，采用0.9%NaCl 清洗較直接用注射用水清洗能更有效地改善水通量.0.9% NaCl 溶液和注射用水清洗使用量達(dá)到20 L/m2時TOC 和水通量改善最為明顯，在總量達(dá)到40 L/m2時趨于平穩(wěn)，從操作和使用成本考慮，采用先用20 L/m20.9% NaCl 溶液清洗后，再用20 L/m2以上注射用水清洗效果較好.

由圖4、5 可知，0.9% NaCl 溶液結(jié)合注射用水清洗清洗量為40 L/m2時，TOC 為657 ppb，0.9%NaCl 溶液結(jié)合注射用水清洗后水通量與圖2 的趨勢相似，能有效地恢復(fù)超濾系統(tǒng)的水通量，達(dá)到6.52 L/min·5 m2，恢復(fù)率為66.4%.另外，實驗取樣檢測的細(xì)菌內(nèi)毒素(鱟試劑法檢測均為陰性)檢查均符合《藥典》對注射用水細(xì)菌內(nèi)毒素檢測要求.

由圖6、7 可知，超濾系統(tǒng)采用0.9% NaCl 溶液結(jié)合注射用水清洗后的微生物限度檢測結(jié)果與單獨采用0.9% NaCl 溶液或注射用水清洗后的微生物限度檢測結(jié)果無明顯變化.

4.2 不同體積的0.5 mol/L NaOH 清洗消毒的有效性

按“3.2”項內(nèi)容進(jìn)行不同體積的0.5 mol/L NaOH 清洗效果實驗，其對TOC、微生物限度和水通量的影響如圖8 ～10 所示.

由圖8 可知，0.5 mol/L NaOH 溶液用量分別為10、15、20、25 L，循環(huán)清洗30 min 時，超濾系統(tǒng)的TOC分別為291、255、240、229 ppb.可見，改變清洗液的體積對超濾系統(tǒng)的TOC 影響不明顯.循環(huán)60 ～90 min 時，TOC 值在230 ～250 ppb 之間，趨于平穩(wěn)，均能夠較好地控制在系統(tǒng)被允許的制品殘留限度范圍.

圖8 0.5 mol/L NaOH 溶液和注射用水清洗后TOC 檢測結(jié)果

圖9 0.5 mol/L NaOH 溶液和注射用水清洗后水通量檢測結(jié)果

圖10 0.5 mol/L NaOH 溶液和注射用水清洗后微生物限度檢測結(jié)果

從圖9 可知，0.5mol/L NaOH 溶液體積為5 L對超濾系統(tǒng)的水通量恢復(fù)率是最低的，其體積≥10 L 時，改變體積對超濾系統(tǒng)的水通量影響不明顯，恢復(fù)率較為穩(wěn)定.0.5 mol/L NaOH 溶液體積≥10 L 循環(huán)清洗15 min 以上時，水通量恢復(fù)率均能大于80%，符合超濾膜堆使用了一次之后，所測出的水通量不應(yīng)低于最初標(biāo)準(zhǔn)60%的標(biāo)準(zhǔn).綜合上述實驗結(jié)果，考慮使用10 L 以上(折合單位面積換算2 L/m2以上)的0.5 mol/L NaOH 溶液循環(huán)60 min 就能有效去除蛋白殘留，并恢復(fù)超濾系統(tǒng)水通量的80%，同時也能有效降低超濾系統(tǒng)中微生物負(fù)荷，起到有效消毒的作用.同時，超濾系統(tǒng)超濾膜堆完整性測試均合格.此表明，聚醚砜材質(zhì)對0.5 mol/L NaOH 溶液有很好的耐受性，可以使用0.5 mol/L NaOH 溶液對聚醚砜材質(zhì)膜進(jìn)行清洗.

從圖10 可知，0.5mol/L NaOH 溶液清洗循環(huán)到30min 時，超濾系統(tǒng)的微生物限度下降的趨勢較為明顯，其5、10、15、20、25 L 的微生物限度檢測結(jié)果分別為12、8、7、7、8 CUF/100 mL，除5 L 外其他體積的0.5 mol/L NaOH 溶液清洗能達(dá)到《藥典》注射用水微生物限度的檢測標(biāo)準(zhǔn):不高于10 CFU/100 mL.當(dāng)循環(huán)60 min 時，系統(tǒng)微生物限度趨于平穩(wěn)，5 L 的檢測結(jié)果為8 CUF/100 mL，而10、15、20、25 L的檢測結(jié)果為2 ～4 CUF/100 mL.

4.3 0.1mol/L NaOH 進(jìn)行循環(huán)貯存及注射用水清洗的有效性

按“3.3”項內(nèi)容進(jìn)行0.1 mol/L NaOH 循環(huán)貯存及注射用水前清洗實驗，其對TOC、水通量和微生物限度的影響見圖11 ～13 所示.

圖11 0.1 mol/L NaOH 進(jìn)行循環(huán)貯存后注射用水前清洗后TOC 檢測結(jié)果

圖12 0.1 mol/L NaOH 進(jìn)行循環(huán)貯存后注射用水前清洗后水通量檢測結(jié)果

圖13 0.1mol/L NaOH 進(jìn)行循環(huán)貯存后注射用水前清洗后微生物限度檢測結(jié)果

由圖11、12 可知，0.1 mol/L NaOH 進(jìn)行循環(huán)貯存后使用注射用水清洗體積達(dá)到20、25、30、40 L/m2時，超濾系統(tǒng)的TOC 檢測結(jié)果分別為，320、326、321、310、318 ppb，TOC 趨于平穩(wěn)，且均小于蛋白殘留允許最大限度969 ppb 的標(biāo)準(zhǔn).同時，超濾系統(tǒng)的水通量平均值為8.30 L/min·5 m2，恢復(fù)率在80%以上，趨于恒定.

由圖13 可知，超濾系統(tǒng)的微生物限度檢測結(jié)果均未出現(xiàn)大于1 CUF/100 mL 的微生物.此外，超濾系統(tǒng)的電導(dǎo)率檢測值為0.5 ～0.8 μs/cm(25 ℃)，符合《藥典》對注射用水≤1.3 μs/cm(25 ℃)的要求.

5 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明:使用0.9% NaCl 溶液，結(jié)合0.5 mol/L 和0.1 mol/L NaOH 溶液對超濾系統(tǒng)進(jìn)行清洗能有效控制超濾系統(tǒng)的微生物量，去除蛋白殘留，并使系統(tǒng)的水通量恢復(fù)到初始水通量的80%;先用20 L/m20.9% NaCl 清洗，再用20 L/m2以上的注射用水清洗后，用2 L/m2量的0.5 mol/L NaOH 循環(huán)60 min 消毒，然后用注射用水沖洗，最后用0.1 mol/L NaOH 溶液對超濾系統(tǒng)進(jìn)行貯存的清洗流程對聚醚砜材質(zhì)的超濾膜的性能無影響，操作簡單，經(jīng)濟(jì)有效，能長期用于聚醚砜材質(zhì)的超濾膜的清洗.

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