小鼠膽囊膽固醇結石模型的建立

毛立梅+戴建華+張晏苗+包蔚雷+高園園+朱春富+張京平

[摘要] 目的 建立簡單、可靠、高效的小鼠膽囊膽固醇結石模型，為研究膽石成因及防治提供重要手段。 方法 C57BL/6小鼠隨機分為對照組和模型組，對照組喂飼基礎飼料，模型組喂飼致石飼料（基礎飼料加10%豬油、1%膽固醇及0.5%膽酸）。兩組小鼠分別于喂養4周和8周后，計算小鼠存活率，同時各取一半數量小鼠在乙醚吸入麻醉下手術取膽囊及血液標本，分別檢測成石率、血脂濃度及膽汁膽固醇飽和度。 結果 對照組小鼠8周存活率100%，模型組小鼠死亡1只，存活率95%。對照組8周成石率為零，模型組4周成石率80%，8周成石率100%。血脂分析表明，與對照組比較，模型組4周和8周總膽固醇及低密度脂蛋白顯著升高（P<0.01），甘油三酯濃度輕度升高（P<0.05），高密度脂蛋白顯著降低（P<0.01）。4周和8周時膽汁膽固醇飽和度測定，對照組分別為0.48±0.29和0.58±0.21，模型組分別為1.36±0.36和1.52±0.37，模型組膽固醇濃度處于過飽和狀態。 結論 本模型方法簡單、成石率高、動物死亡率低，可作為研究膽石成因及防治的備選模型。

[關鍵詞] 膽固醇結石；膽囊；模型；小鼠

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）06-30-04

膽囊結石（主要為膽固醇結石）是常見病，且其發病率有增高趨勢[1]。目前膽囊結石的形成機制尚不清楚[2-3]。建立方法簡單、效果確切的膽囊結石動物模型可以為研究膽石成因及其防治提供極大便利。本文介紹一種簡單、高效的C57BL/6小鼠膽

囊膽固醇結石模型的建立方法。

1 材料與方法

1.1 飼料及處理

基礎飼料按照美國營養學會嚙齒類AIN-93標準配方制定[4]。致石飼料為基礎飼料加10%豬油、1%膽固醇及0.5%膽酸。致石飼料在喂飼前放于蒸籠中蒸汽熏蒸20min，取出適當冷卻后使用。

1.2 動物及分組

C57BL/6小鼠32只，8周齡，雌雄各半，清潔級，購自上海斯萊克實驗動物中心。購入后經普通基礎飼料喂養2周后，隨機分為兩組，對照組12只，雌雄各半，每日以普通基礎飼料喂養；模型組20只，雌雄各半，每日以致石飼料喂養。兩組小鼠分別于喂養4周和8周后，各取一半數量小鼠在乙醚吸入麻醉下手術取材作相關指標檢測。

1.3 小鼠存活率測定

飼養過程中記錄各組小鼠存活情況，計算存活率。

1.4 膽囊膽固醇結石觀測

各組分別取膽囊，在顯微鏡下觀察膽固醇結晶形成情況；抽取膽囊膽汁，1000rpm離心后取沉渣在顯微鏡下觀察膽固醇結晶形成情況，采用紅外光譜溴化鉀壓片法鑒定結石性質[5-6]。

1.5 血脂測定

經心臟穿刺抽血，分離血漿后采用CX-7型全自動生化分析儀（美國Beckman）測定血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）濃度。

1.6 膽囊膽汁膽固醇飽和度測定

抽取膽囊膽汁，離心去除膽固醇結晶，經適當稀釋后在全自動生化分析儀上測定膽汁總膽固醇、磷脂和總膽汁酸，通過Carey表[7]計算膽固醇飽和指數（cholesterol saturation index，CSI）。

1.7 統計學分析

計量資料采用（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，SPSS11.5進行統計學分析，P<0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠存活情況

對照組小鼠在8周飼養過程中全部存活，存活率100%。模型組小鼠在飼養過程中死亡1只，存活率95%。

2.2 成石情況

對照組4周和8周膽囊內膽汁澄清，皆未見結石結晶形成（圖1-A，圖2-A），成石率為零。模型組4周時即見膽囊內膽汁渾濁，10只小鼠中有8只可見結石結晶形成，成石率為80%，8周時剩余9只全部檢測到結石，成石率為100%（圖1-B，圖2-B），紅外光譜溴化鉀壓片法鑒定為膽固醇結石。

A 對照組膽囊

B 模型組膽囊

A 對照組膽汁

B 模型組膽汁

2.3 各組血脂測定結果

兩組小鼠不同時間點血脂水平見表2。與對照組比較，模型組4周和8周TC濃度顯著升高（P<0.01）；模型組8周與4周時比較無顯著差異（P>0.05），說明模型組4周時血液總膽固醇濃度已處于較高水平，繼續致石飼料飼養并不能進一步顯著增高總膽固醇濃度。與對照組比較，模型組4周和8周TG濃度輕度升高（P<0.05），升高幅度小于TC。與對照組比較，模型組4周和8周HDL-C顯著降低（P<0.01），而LDL-C顯著升高（P<0.01）。

2.4 CSI測定結果

對照組小鼠4周和8周時CSI分別為0.48±0.29和0.58±0.21，皆小于1，說明膽固醇處于未飽和狀態。模型組小鼠4周和8周時CSI分別為1.36±0.36和1.52±0.37，皆大于1，說明膽固醇濃度處于過飽和狀態。

3 討論

建立理想的膽囊膽固醇結石動物模型是研究膽石成因及其防治的重要手段。目前已有較多文獻報道建立膽囊膽固醇結石模型的方法[8-11]，但尚無統一、標準化的方法。理想的動物模型要求動物獲取方便、造模方法簡單、成石率高、可重復性好和動物死亡率低等。我們在借鑒文獻介紹方法的基礎上，成功建立了C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結石動物模型。我們的結果表明，該造模方法具有簡單、實用、成石率高及動物存活率高等優點。endprint

對于造模動物的選擇，小鼠、豚鼠和兔等是常用的造模動物[8-10]。相對于其他動物而言，小鼠尤其是C57BL/6小鼠具有價格低廉、獲取方便，同時針對小鼠的各種抗體及檢測方法等亦更加豐富與齊全。因此我們選擇了C57BL/6小鼠作為造模對象。致石飼料是建立膽囊膽固醇結石模型的關鍵因素[8-12]。在我們的前期實驗中，我們綜合文獻介紹的方法，采用的飼料配方包括基礎飼料加膽固醇、蛋黃粉、蔗糖等成分及較高濃度的豬油（15%）和膽酸（1%），盡管獲得了較高的成石率（8周100%），但實驗小鼠不愿進食或進食量較少，存活率較低（約40%到70%）。分析其原因可能與致石飼料中成分較多、脂類與膽酸含量較高、成品飼料質地偏硬、油脂味較重，導致小鼠咬食困難或不愿意進食等因素有關。在本研究中，我們去除了飼料中非必須成分，并降低了豬油與膽酸的濃度；同時，為降低飼料的硬度，我們在喂飼前將飼料在蒸汽中熏蒸，使其變松軟后再喂飼，小鼠進食量明顯增多。本研究結果表明，該配方簡單，成石率高，動物存活率較高，8周造模完成時存活率達95%。

高脂物質的攝入及高血脂形成是人類膽固醇結石形成過程中的重要環節之一[13-14]。本模型中，小鼠在喂飼致石飼料后4周即出現了高血脂，其中主要為總膽固醇的顯著升高以及甘油三酯的輕度升高。同時，脂蛋白濃度亦出現了相應的改變。在膽固醇結石形成機制中，目前認為膽汁成分中膽固醇過飽和是形成膽固醇結石的重要條件[15-16]。在本模型中，我們檢測到實驗組小鼠膽固醇飽和指數大于1，即膽固醇過飽和的存在。因此，本模型通過攝入高脂物質形成高血脂、膽汁膽固醇過飽和，最終導致膽固醇結石形成，有效地模擬了人膽固醇結石的形成過程，不失為研究膽固醇結石形成機制及防治的較好模型。

[參考文獻]

[1] 蔣兆彥，韓天權，張圣道.從膽石成因研究談膽石病預防的新策略[J].中華肝膽外科雜志，2011，17（9）：697-700.

[2] 李哲夫，陳孝平.膽固醇膽石成因的研究進展[J].中國普通外科雜志，2007，16（2）：170-172.

[3] 倪健彬，徐松波，李波.膽囊膽固醇結石的成因研究進展[J].醫學綜述，2009，15（17）：2581-2583.

[4] Reeves PG，Nielsen FH，Fahey GC Jr.AIN-93 purified diets for laboratory rodents：final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet[J]. J Nutr，1993，123（11）：1939-1951.

[5] 羅亞男，涂國菊，宋精靈，等.膽固醇結石紅外光譜分層分析[J].黔南民族醫專學報，2011，24（1）：6-8.

[6] 安國順，王海梅，巴圖烏拉，等. C57BL/6小鼠膽結石形成中固醇載體蛋白2的mRNA水平和膽固醇飽和指數增高[J]. 基礎與臨床醫學，2006，26（10）：1108-1111.

[7] Carey MC.Critical tables for calculating the cholesterol saturation of native bi1e[J].J Lipid Res，1978，19（8）：945-955.

[8] 陳永生，田雨，吳碩東.C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結石模型的建立[J].中華實驗外科雜志，2011，28（12）：2257.

[9] 李炯，張靜喆，鄒長鵬，等.升清膠囊下調膽囊結石豚鼠膽囊上皮組織雌、孕激素受體[J].中西醫結合學報，2008， 6（10）：1040-1044.

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[10] 舒曄，趙紀春，周總光，等.高密度及低密度脂蛋白受體在兔膽囊結石成石中的變化及意義[J].中國普外基礎與臨床雜志，2000，7（2）：72-75.

[11] 朱振家，錢之玉，包晨穎.京尼平苷對地鼠膽固醇結石形成的影響[J].中草藥，2001，32（6）：530-532.

[12] 張靜喆，梁曉強，顧宏剛，等.不同治則中藥對膽囊膽固醇結石小鼠模型的成石影響[J].中國中西醫結合外科雜志， 2009，15（3）：291-294.

[13] 許國強，許驍瑋，胡鳳玲，等.膽囊結石中膽固醇含量及與血脂水平的關系[J].中華消化雜志，2008，28（11）： 780-782.

[14] 韓濤，張殿彩，傅贊.膽固醇代謝異常與膽固醇結石形成的研究進展[J].江蘇醫藥，2012，38（15）：1811-1814.

[15] 吳孟超，吳在德.黃家駟外科學[M].第7版.北京：人民衛生出版社，2008：1790-1794.

[16] 蔣兆彥，姜翀弋，胡海，等.膽固醇結石病人肝臟脂質代謝異常的分子生物學研究[J].外科理論與實踐，2007，12（5）：414-421.

（收稿日期：2013-12-10）endprint

對于造模動物的選擇，小鼠、豚鼠和兔等是常用的造模動物[8-10]。相對于其他動物而言，小鼠尤其是C57BL/6小鼠具有價格低廉、獲取方便，同時針對小鼠的各種抗體及檢測方法等亦更加豐富與齊全。因此我們選擇了C57BL/6小鼠作為造模對象。致石飼料是建立膽囊膽固醇結石模型的關鍵因素[8-12]。在我們的前期實驗中，我們綜合文獻介紹的方法，采用的飼料配方包括基礎飼料加膽固醇、蛋黃粉、蔗糖等成分及較高濃度的豬油（15%）和膽酸（1%），盡管獲得了較高的成石率（8周100%），但實驗小鼠不愿進食或進食量較少，存活率較低（約40%到70%）。分析其原因可能與致石飼料中成分較多、脂類與膽酸含量較高、成品飼料質地偏硬、油脂味較重，導致小鼠咬食困難或不愿意進食等因素有關。在本研究中，我們去除了飼料中非必須成分，并降低了豬油與膽酸的濃度；同時，為降低飼料的硬度，我們在喂飼前將飼料在蒸汽中熏蒸，使其變松軟后再喂飼，小鼠進食量明顯增多。本研究結果表明，該配方簡單，成石率高，動物存活率較高，8周造模完成時存活率達95%。

高脂物質的攝入及高血脂形成是人類膽固醇結石形成過程中的重要環節之一[13-14]。本模型中，小鼠在喂飼致石飼料后4周即出現了高血脂，其中主要為總膽固醇的顯著升高以及甘油三酯的輕度升高。同時，脂蛋白濃度亦出現了相應的改變。在膽固醇結石形成機制中，目前認為膽汁成分中膽固醇過飽和是形成膽固醇結石的重要條件[15-16]。在本模型中，我們檢測到實驗組小鼠膽固醇飽和指數大于1，即膽固醇過飽和的存在。因此，本模型通過攝入高脂物質形成高血脂、膽汁膽固醇過飽和，最終導致膽固醇結石形成，有效地模擬了人膽固醇結石的形成過程，不失為研究膽固醇結石形成機制及防治的較好模型。

[參考文獻]

[1] 蔣兆彥，韓天權，張圣道.從膽石成因研究談膽石病預防的新策略[J].中華肝膽外科雜志，2011，17（9）：697-700.

[2] 李哲夫，陳孝平.膽固醇膽石成因的研究進展[J].中國普通外科雜志，2007，16（2）：170-172.

[3] 倪健彬，徐松波，李波.膽囊膽固醇結石的成因研究進展[J].醫學綜述，2009，15（17）：2581-2583.

[4] Reeves PG，Nielsen FH，Fahey GC Jr.AIN-93 purified diets for laboratory rodents：final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet[J]. J Nutr，1993，123（11）：1939-1951.

[5] 羅亞男，涂國菊，宋精靈，等.膽固醇結石紅外光譜分層分析[J].黔南民族醫專學報，2011，24（1）：6-8.

[6] 安國順，王海梅，巴圖烏拉，等. C57BL/6小鼠膽結石形成中固醇載體蛋白2的mRNA水平和膽固醇飽和指數增高[J]. 基礎與臨床醫學，2006，26（10）：1108-1111.

[7] Carey MC.Critical tables for calculating the cholesterol saturation of native bi1e[J].J Lipid Res，1978，19（8）：945-955.

[8] 陳永生，田雨，吳碩東.C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結石模型的建立[J].中華實驗外科雜志，2011，28（12）：2257.

[9] 李炯，張靜喆，鄒長鵬，等.升清膠囊下調膽囊結石豚鼠膽囊上皮組織雌、孕激素受體[J].中西醫結合學報，2008， 6（10）：1040-1044.

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[10] 舒曄，趙紀春，周總光，等.高密度及低密度脂蛋白受體在兔膽囊結石成石中的變化及意義[J].中國普外基礎與臨床雜志，2000，7（2）：72-75.

[11] 朱振家，錢之玉，包晨穎.京尼平苷對地鼠膽固醇結石形成的影響[J].中草藥，2001，32（6）：530-532.

[12] 張靜喆，梁曉強，顧宏剛，等.不同治則中藥對膽囊膽固醇結石小鼠模型的成石影響[J].中國中西醫結合外科雜志， 2009，15（3）：291-294.

[13] 許國強，許驍瑋，胡鳳玲，等.膽囊結石中膽固醇含量及與血脂水平的關系[J].中華消化雜志，2008，28（11）： 780-782.

[14] 韓濤，張殿彩，傅贊.膽固醇代謝異常與膽固醇結石形成的研究進展[J].江蘇醫藥，2012，38（15）：1811-1814.

[15] 吳孟超，吳在德.黃家駟外科學[M].第7版.北京：人民衛生出版社，2008：1790-1794.

[16] 蔣兆彥，姜翀弋，胡海，等.膽固醇結石病人肝臟脂質代謝異常的分子生物學研究[J].外科理論與實踐，2007，12（5）：414-421.

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對于造模動物的選擇，小鼠、豚鼠和兔等是常用的造模動物[8-10]。相對于其他動物而言，小鼠尤其是C57BL/6小鼠具有價格低廉、獲取方便，同時針對小鼠的各種抗體及檢測方法等亦更加豐富與齊全。因此我們選擇了C57BL/6小鼠作為造模對象。致石飼料是建立膽囊膽固醇結石模型的關鍵因素[8-12]。在我們的前期實驗中，我們綜合文獻介紹的方法，采用的飼料配方包括基礎飼料加膽固醇、蛋黃粉、蔗糖等成分及較高濃度的豬油（15%）和膽酸（1%），盡管獲得了較高的成石率（8周100%），但實驗小鼠不愿進食或進食量較少，存活率較低（約40%到70%）。分析其原因可能與致石飼料中成分較多、脂類與膽酸含量較高、成品飼料質地偏硬、油脂味較重，導致小鼠咬食困難或不愿意進食等因素有關。在本研究中，我們去除了飼料中非必須成分，并降低了豬油與膽酸的濃度；同時，為降低飼料的硬度，我們在喂飼前將飼料在蒸汽中熏蒸，使其變松軟后再喂飼，小鼠進食量明顯增多。本研究結果表明，該配方簡單，成石率高，動物存活率較高，8周造模完成時存活率達95%。

高脂物質的攝入及高血脂形成是人類膽固醇結石形成過程中的重要環節之一[13-14]。本模型中，小鼠在喂飼致石飼料后4周即出現了高血脂，其中主要為總膽固醇的顯著升高以及甘油三酯的輕度升高。同時，脂蛋白濃度亦出現了相應的改變。在膽固醇結石形成機制中，目前認為膽汁成分中膽固醇過飽和是形成膽固醇結石的重要條件[15-16]。在本模型中，我們檢測到實驗組小鼠膽固醇飽和指數大于1，即膽固醇過飽和的存在。因此，本模型通過攝入高脂物質形成高血脂、膽汁膽固醇過飽和，最終導致膽固醇結石形成，有效地模擬了人膽固醇結石的形成過程，不失為研究膽固醇結石形成機制及防治的較好模型。

[參考文獻]

[1] 蔣兆彥，韓天權，張圣道.從膽石成因研究談膽石病預防的新策略[J].中華肝膽外科雜志，2011，17（9）：697-700.

[2] 李哲夫，陳孝平.膽固醇膽石成因的研究進展[J].中國普通外科雜志，2007，16（2）：170-172.

[3] 倪健彬，徐松波，李波.膽囊膽固醇結石的成因研究進展[J].醫學綜述，2009，15（17）：2581-2583.

[4] Reeves PG，Nielsen FH，Fahey GC Jr.AIN-93 purified diets for laboratory rodents：final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet[J]. J Nutr，1993，123（11）：1939-1951.

[5] 羅亞男，涂國菊，宋精靈，等.膽固醇結石紅外光譜分層分析[J].黔南民族醫專學報，2011，24（1）：6-8.

[6] 安國順，王海梅，巴圖烏拉，等. C57BL/6小鼠膽結石形成中固醇載體蛋白2的mRNA水平和膽固醇飽和指數增高[J]. 基礎與臨床醫學，2006，26（10）：1108-1111.

[7] Carey MC.Critical tables for calculating the cholesterol saturation of native bi1e[J].J Lipid Res，1978，19（8）：945-955.

[8] 陳永生，田雨，吳碩東.C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結石模型的建立[J].中華實驗外科雜志，2011，28（12）：2257.

[9] 李炯，張靜喆，鄒長鵬，等.升清膠囊下調膽囊結石豚鼠膽囊上皮組織雌、孕激素受體[J].中西醫結合學報，2008， 6（10）：1040-1044.

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[10] 舒曄，趙紀春，周總光，等.高密度及低密度脂蛋白受體在兔膽囊結石成石中的變化及意義[J].中國普外基礎與臨床雜志，2000，7（2）：72-75.

[11] 朱振家，錢之玉，包晨穎.京尼平苷對地鼠膽固醇結石形成的影響[J].中草藥，2001，32（6）：530-532.

[12] 張靜喆，梁曉強，顧宏剛，等.不同治則中藥對膽囊膽固醇結石小鼠模型的成石影響[J].中國中西醫結合外科雜志， 2009，15（3）：291-294.

[13] 許國強，許驍瑋，胡鳳玲，等.膽囊結石中膽固醇含量及與血脂水平的關系[J].中華消化雜志，2008，28（11）： 780-782.

[14] 韓濤，張殿彩，傅贊.膽固醇代謝異常與膽固醇結石形成的研究進展[J].江蘇醫藥，2012，38（15）：1811-1814.

[15] 吳孟超，吳在德.黃家駟外科學[M].第7版.北京：人民衛生出版社，2008：1790-1794.

[16] 蔣兆彥，姜翀弋，胡海，等.膽固醇結石病人肝臟脂質代謝異常的分子生物學研究[J].外科理論與實踐，2007，12（5）：414-421.

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