羥基酪醇對過度訓練大鼠心肌線粒體動力學蛋白及自噬水平的影響

孫云彥+殷紅

摘要：目的： 研究檢測ET后心肌線粒體功能，觀察羥基酪醇HT對線粒體功的保護效應，并通過關注動力學及自噬蛋白變化，探討HT保護機制。方法： 80只SD大鼠隨機分成4組，即：正常對照組（CON），正常加羥基酪醇組（CON+HT），過度訓練組（ET）及訓練加羥基酪醇組（ET+HT）。灌胃給藥，劑量為25 mg/kg/d，每周訓練時間為周一至周六，共8周，氧耗法測定線粒體呼吸功能。Westerblot法檢測線粒體生物合成（PGC-1α），復合物（I，II，III，IV，V），動力學（融合：Mfn1/2，OPA1；裂解：Drp1）及自噬相關蛋白（Atg5，Beclin-1及Lc3-B）。結果： ET可顯著性降低線粒體呼吸控制率（RCR）及磷氧比值（P/O），下調PGC-1α及復合物I，IV，V表達，增加線粒體裂解（Drp1），降低融合 （Mfn2，Opa1）。相對地，HT可有效提高線粒體P/O及復合物I，V表達水平；促進生物合成（Pgc-1α），提高融合（Mfn2，Opa1），降低裂解（Drp1）和自噬 （Atg5，Lc3-B）。結論：ET造成的心肌線粒體功能異常與動力學蛋白及自噬水平變化相關。HT對上述病理性變化的抑制作用可能是其發揮保護作用的重要機制。

關鍵詞：過度訓練；心肌；生物合成；裂解；融合；自噬

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2014）03-0051-06

收稿日期：2014-01-09

基金項目：國家青年科學基金資助項目（81100174）。

作者簡介：孫云彥（1982-），女，河南鄧州人，在讀博士，講師，研究方向運動性疾病及康復。

作者單位：1.南陽理工學院體育教學部，河南 南陽473003；2.河南大學體育學院，河南 開封475000

山東體育學院學報第30卷第3期2014年6月 孫云彥，等羥基酪醇對過度訓練大鼠心肌線粒體動力學蛋白及自噬水平的影響No.3 2014過度訓練（excessive training，ET）是一種訓練與恢復、運動與運動能力、應激與應激耐受性之間的失衡狀態，是指機體由于疲勞的連續積累而導致機體出現功能紊亂或病理狀態[1]。現已研究證實，過度訓練可損傷機體循環系統，引起心肌能量代謝酶，抗氧化蛋白表達水平降低[2-3]及心肌細胞凋亡水平增加[4]。另有研究指出，過度訓練還可直接造成心肌線粒體膜通透性轉換孔的開放[5]。上述病理性改變，均與線粒體損傷及功能異常直接相關。然而，有關過度訓練與心肌線粒體功能異常關系的研究卻鮮有報道。

羥基酪醇（Hydroxytyrosol，HT）存在于橄欖葉提取物及橄欖油， 是一種多羥基酚類化合物。其分子式為C8H10O3，相對分子量為154.16。研究證實，羥基酪醇在心血管疾病[6-8]及衰老相關性退行性病變，如二型糖尿病[9]，代謝綜合征[10]等的治療中均有出色效果。推測，HT也能對過度訓練造成的心肌損傷（線粒體功能紊亂）產生積極影響。另外，新近研究指出，線粒體動力學蛋白[11-12]和線粒體自噬[13]與其功能密切相關。眾多與線粒體功能紊亂相關疾病的形成和發生均與動力學蛋白及自噬水平的病理性改變密切相關[11-12，14-16]。因此，線粒體融合，裂解和自噬成為近年來生命科學及醫學領域內研究的新熱點。

基于此，本研究建立了過度訓練模型，并用HT作為干預手段，通過關注心肌線粒動力學蛋白及自噬水平的變化，探討HT對心肌線粒體的保護作用及內在機制。

1材料和方法

1.1實驗藥劑

HT是由帝斯曼營養產品有限公司（Basel， Switzerland）提供的含量為15%的橄欖提取物粉末（19%總多酚）。抗體過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1 （Pgc-1） α，線粒體融合蛋白（Mfn） 1，2，裂解蛋白（Drp） 1購自于Santa公司 （Santa Cruz， CA，USA）；抗體GAPDH，視神經萎縮蛋白（Opa） 1，微管相關蛋白1輕鏈3（Lc3B），Beclin-1及 自噬蛋白（Atg） 5 購于Cell Signaling Technology （Danvers，MA，USA）。抗體線粒體復合物I，II，III，IV和 V來自于Sigma公司（Sigma，USA）。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗小鼠IgG抗體（GAPDH）及二抗購自于碧云天 （Beyotime，北京）公司；甘氨酸，Tris-base （AMRESCO，USA）；NC膜，ECL發光試劑購自于密理博 （MILLIPORE，USA）。

1.2研究對象

雄性Sprague dawley （SD）大鼠80只（購于鄭州大學醫學院動物中心），6～8周齡，體重185～215 g。以國家標準嚙齒類動物飼料分籠飼養，每籠20只，自由飲食。實驗大鼠飼養于溫度為22℃～25℃，相對濕度為40%～60%，光照充足的動物飼養房。在正式的力竭實驗開始之前，所有大鼠進行低強度訓練 （10 m/min， 20 min/d） 進行篩選及分組。分選完成后，大鼠分4組。即：對照組（CON），安靜+HT組（HT），過度訓練組（ET）和過度訓練+HT組（ET+HT）。

1.3運動方案

過度訓練模型主要參考劉無逸等方法[17]。BW-BTM703型動物跑臺（上海軟隆科技）進行訓練，坡度為5°，每周訓練6 （周一至周六）天，休息1天。訓練時間共計8周。各周訓練方案具體如下：①：10 m/min，15 min；②：24 m/min，60 min；③：30 m/min，90 min；④：40 m/min，120 min；⑤～⑧：40 m/min，訓練直至力竭。當體重下降幅度大于一般訓練時體重的1/30及跑速和時間減為原最大值的1/3～1/6時為過度訓練狀態[18-19]。

1.4HT給藥方案

HT采用灌胃給藥，具體用量25 mg/kg體重[20]。每日1次， 每周6天（周一到周六），連續8周。對照組和過度訓練組不給藥。

1.5透射電鏡檢測進行形態學觀察

電鏡樣品制備及檢測主要參考朱健等方法[21]。在最后一次力竭訓練結束即刻處死大鼠，采用在體灌注法對大鼠心臟進行固定。簡要如下：麻醉動物置于試驗臺，暴露心臟，打開右心耳，用加肝素的生理鹽水刺入左心室進行1min左右灌注。之后，用灌注液 （0.2 M磷酸緩沖液的配制100 ml 25%戊二醛4 ml，重蒸餾水加到200 ml）灌流心臟。待右心耳流出液為無色時，換固定液（NaH2PO4·H2O 2.6 g，Na2HPO4·12H2O29 g，重蒸餾水 加至500 ml，調pH至7.4）對大鼠進行全身固定。待動物全身僵硬后，取左心室相關組織，再用4%戊二醛固定液浸透法固定材料，制備成1 mm3樣品。之后送電鏡中心進行鏡下觀察和拍照。

1.6線粒體呼抽取及呼吸功能檢測

心肌組織切碎后，在4 ℃介質（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl pH=7.4，0℃～4℃）中制備心肌組織勻漿。勻漿首先經750 g離心10 min后留上清，之后，以9 000 g離心20 min后留沉淀，重新懸浮后以9 000 g再離心20 min，棄上清得線粒體。全部操作于4 ℃進行。線粒體呼吸功能用氧耗儀 （YSI，Ohio，USA）測定，方法參考Bo等方法[22]。簡要如下：反應體系在一個3 ml封閉的帶磁力攪拌器的玻璃槽內進行，其中包含130 mM KCl，3.0 mM HEPES，0.5 mM EDTA，2.0 mM KH2PO4，1 mg/ml BSA和2 mg線粒體蛋白，pH值為7.4，反應溫度為25℃。當線粒體置于反應槽后，首先平衡3 min，之后向反應槽中加入1 mM谷氨酸鹽及終濃度為0.1 mM蘋果酸，以啟動線粒體呼吸。在加入200 nM ADP后，線粒體進入三態呼吸。當呼吸曲線出現明顯拐角時，提示呼吸過程進入四態。線粒體呼吸控制率用三態呼吸除以四態呼吸的比值表示。加入的ADP除以氧耗量，即：磷氧比值 （P/O）表示線粒體能量合成水平。

1.7Western Blot 印跡檢測各組大鼠心肌組織蛋白表達

選取-80℃冰箱凍存的心肌組織～120 mg，經超聲粉碎，勻漿，變性，定量（BCA法）后，各取25 μg蛋白用于蛋白表達的印跡檢測。簡要如下：25 μg蛋白經8%～12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，通過轉膜儀 （DYCZ-25D，北京沃德仁和生物）將蛋白轉移至NC膜。之后，蛋白與對應一抗（Pgc-1α，COX I，II，III，IV，V，Atg5，Bclin-1，兔抗大鼠單克隆抗體按照體積比為1：2000稀釋；Mfn1，Mfn2，Drp1，Opa1，Lc3B單克隆抗體按照體積比為1：1000稀釋）反應（4℃過夜或常溫6 h）混合孵育。膜經封閉、洗脫（5 min×3）后，再和對應的二抗孵育。洗脫二抗（5 min×3），用發光液（ECL）發光，X光片曝光顯像。采用圖像分析軟件Quantity one （Bio-Rad，California，USA）作灰度分析統計。分析過程按照以下步驟進行：首先根據條帶位置創建泳道，用背景分析及區域分布進行泳道背景的排除，接下來進行條帶創建，最后進行高斯建模與結果分析。

1.8統計學處理

采用PASW SPSS 20.0 （IBM，Armonk，New York，USA）分析結果，用平均值±標準差（M± SD）表示。組間比較用單因素方差分析（Student's t-test or ANOVA），P< 0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。GraphPad Software Prism 6.01（GraphPad Software，La Jolla，California，USA）統計作圖。

2結果

2.1羥基酪醇對SD大鼠心肌組織線粒體形態結構的影響

為了檢測HT對心肌組織線粒體功能的影響，首先用透射電鏡觀察線粒體形態學的變化。圖1結果顯示，CON組心肌纖維排列整齊，肌絲光滑完整；線粒體輪廓清晰，內外膜結構完整。HT組線粒體形態與CON組相似，密度有所增加。ET組大鼠線粒體發生腫脹，水性變及空泡化，內膜、嵴破壞溶解改變。HT可減輕上述病理性變化，如減少膜結構損傷，維持嵴形態，減少內容物溶解及空泡化等。

形態決定功能。ET引起的線粒體形態學的改變必定會造成其功能發生變化。接下來，檢測了線粒體呼吸功能的變化。如圖2所示，與對照組相比，過度訓練造成線粒體三態呼吸水平降低和四態呼吸水平升高，從而造成線粒呼吸比率 （RCR=State3/State 4）降低，P/O水平也顯著性降低（P<0.05）。雖然HT可提高線粒體三態呼吸和P/O水平（P<0.05），但對RCR并不具有顯著性影響。

3討論

本研究結果顯示，過度訓練可以引起心肌組織線粒體呼吸功能紊亂，其原因部分是由于ET對心肌線粒體動力學及自噬相關蛋白的病理性重塑。HT可有效維持線粒體形態結構完整及呼吸功能正常。其可能是通過抑制線粒體動力學蛋白病理性重塑及減低自噬水平而實現。下面將從HT對動力學蛋白的重塑及自噬調節兩方面展開討論。

3.1HT抑制ET對動力學蛋白的病理性重構作用

過度訓練可造成心肌損傷。彭等研究指出，ET可造成心肌能量代謝酶（CK、LDH、SDH）及ATP酶的活性水平降低，同時還造成心肌組織抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）水平降低[2]。容等研究顯示，ET可造成過度訓練大鼠心肌細胞凋亡及炎性反應[25]。而上述病理性變化均和線粒體功能異常密切相關。本研究顯示，ET可造成線粒體結構損傷和功能異常（RCR降低，P/O下降及復合物蛋白I，IV，V表達降低）（圖1和圖2）。相對地，HT可有效抑制或逆轉這些病理性變化。

線粒體融合蛋白（Mfn）主要內膜融合蛋白及外膜融合蛋白所構成。其中，外膜融合蛋白由有Mfn1和Mfn2亞型構成，完成線粒體融合過程中的外膜融合。而Opa1主要是在內膜融合過程中發揮作用。線粒體裂解過程主要有Drp1所主導。Drp1位于細胞漿，當線粒體受損，可轉位到線粒體與Fis1蛋白結合介導裂解事件的發生。適度的溶解和裂解對于維持線粒體正常功能，如結構的完整性，ETC蛋白活性，呼吸耦聯，氧化磷酸化水平及能量輸出等，發揮重要作用[14]。一旦上述穩態被打破，即可引起多種疾病，如心血管疾病[16]、二型糖尿病[23]等。相對地，過表達線粒體融合蛋白Mfn1/2 及Opa1，則可有效抑制心血管疾病的發生[26]。本研究顯示，ET可造成線粒體融合降低及裂解增多。該結果和過度訓練對骨骼肌的影響相似[20]。推測，這可能是機體的一種自我保護機制，因為線粒體片段結構的增多能夠加速糖原和丙酮酸的利用，遏制氧化磷酸化功能降低。然而，上述變化雖然可能代償性的加速線粒體在細胞內的運動速率（到達能量需要部位），但過度裂解可造成線粒體碎片結構增加（結構不完整），從而降低線粒體功能。就運動應激與線粒體形態結構的相關基因表達而言，不同的運動方式產生各異的影響效果。一次或重復進行的耐力訓練可對相關基因和蛋白產生良性作用效果，如增加細胞氧耗，提高復合物蛋白活性及增加線粒體生物合成等[27]。然而，過度訓練，如本研究所示，可造成線粒體生物合成水平降低，能量合成下降 （圖3、圖4）。就調節機制而言，新近研究顯示，Pgc-1α對動力學的相關基因發揮調控作用[28]。然而具體調節機制尚不明確。另外，有研究指出，ROS參與了線粒體的裂解過程[29]，ET造成的線粒體功能異常可能與其引起的氧化應激損傷相關。

與對照組相比，HT可部分提高線粒體融合及下調裂解水平。但具體調節機制尚不清楚。近年來研究證實，Pgc-1α參與了對融合和裂解的調節過程[30]。本研究證實，HT可提高Pgc-1α表達水平（圖3）。這和之前相關研究結果一致[31]。關于HT對Pgc-1α的調節作用，有研究指出主要是通過提高AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）蛋白的磷酸化水平[32]而實現。另外，HT的抗氧化作用可能是其降低裂解的原因之一[31]。HT不僅能夠活化AMPK，增加叉頭蛋白（FOXO）3a向細胞核內的定位，上調線粒體抗氧化酶，如：過氧化氫酶（catalase），錳SOD （MnSOD）等[15]，還可促進KELCH狀ECH-相關蛋白1（Keap1）與核呼吸因子（Nrf）2的解離，加速Nrf2的核定位而轉錄調節二相抗氧化酶的表達水平[33]。

3.2 HT降低ET引起自噬水平升高

自噬是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，藉此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。研究顯示，眾多疾病的發生都伴隨著自噬水平的異常變化，如癌癥[34]、原發性高血壓[35]、衰老[24]等。就運動對自噬的影響，其主要決定于不同的運動方案。研究證實，中等強度的耐力訓練可有效提高自噬水平[36-37]，并認為自噬水平的上調是運動引起保護作用的重要機制之一。然而，過度訓練狀態下自噬水平的變化如何，尚未見到相關報道。本研究首次證實，過度訓練可造成心肌線粒體自噬水平異常升高（過度自噬，對正常線粒體形態和功能構成威脅），這可能是其造成線粒體功能異常的重要原因之一，但具體機制尚不清楚。有研究指出，過度訓練可上調Foxo3a表達水平，提高自噬水平[20]。另有研究顯示，氧化應激信號通路的激活是造成過度自噬發生的重要機制[34， 38]。提示，過度訓練引起的氧化應激損傷可能是造成自噬水平異常的潛在機制。HT被證實能夠對各種病例狀態下自噬水平產生積極影響[20， 39-40]。本研究也證實，HT可有效降低ET引起的線粒體過度自噬（圖5）。提示，HT對自噬的調節具有雙向性。雖然HT可通過c-Jun氨基末端激酶（JNK） -p62信號通路增加二相抗氧化酶[41]，但有研究指出HT可失活細胞外信號調節激酶（ERK）1/2-JNK通路抑制自噬[34]。所以，HT介導的抗氧化作用對自噬的影響機制仍需進一步研究。

4結論

ET可造成心肌組織線粒體損傷及呼吸功能異常，該病理性變化與動力學蛋白異常重塑及自噬水平提高相關。HT可有效維持線粒體結構完整及功能正常，其作用機制可能是通過，至少部分通過維持動力學蛋白正常表達及降低自噬。提示，HT可作為預防和治療ET引起的心肌線粒體功能紊亂的有效方法。

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