蜂毒肽抗腫瘤機制及臨床應用進展

李迎濤，姜寶華，閆路娜，邱 丹，王 莉

（1.河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北政法職業(yè)學院 公共基礎部，河北 石家莊 050061）

蜂毒肽抗腫瘤機制及臨床應用進展

李迎濤1，姜寶華2，閆路娜1，邱 丹1，王 莉1

（1.河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北政法職業(yè)學院 公共基礎部，河北 石家莊 050061）

蜂毒肽（Melittin，MLT）是蜂毒的主要成分，在蜂毒中含量最高，大約為蜂毒干重的50%，是蜂毒生物活性的主要載體。蜂毒肽作為一種重要的抗菌肽具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗輻射、抑制血小板凝集、抗艾滋病病毒等多種藥理學作用。目前，蜂毒肽已成為抗腫瘤新藥中的研究熱點。本文綜述了最新的蜂毒肽抗腫瘤機制及其應用，若將各種蜂毒制劑聯(lián)合化療，具有減毒增效的作用，在臨床上具有很好的療效，其潛在的藥用價值日益引起人們的重視。

腫瘤；蜂毒肽；凋亡；調(diào)控機制

蜂毒是一種成分復雜的混合物，主要含蛋白質(zhì)、肽類、生物胺和其他小分子有機物。蛋白質(zhì)類主要有透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase）和磷脂酶A2（phospholipase，PLA2）；肽類主要有蜂毒溶血肽（又稱蜂毒肽，melittin）、蜂毒明肽（apamin）和肥大細胞脫粒肽（mast cell degranulating peptide，MCD肽）；生物胺主要有組胺、多巴胺、去甲腎上腺素和氨基丁酸；小分子有機物主要有糖類、磷脂類、氨基酸類、膽堿、甘油和揮發(fā)性化合物（一種信息素）。蜂毒溶血肽（Melittin，MLT）占蜂毒的40%以上，是蜂毒發(fā)揮藥理作用和生物活性的主要成分。其作為一種重要的抗菌肽具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗輻射、抑制血小板凝集、抗艾滋病病毒等多種藥理學作用。國外類似的制劑有英國BVV藥廠的Melittin，蘇聯(lián)的Aplite。這些制劑已除去了蜂毒中引起過敏的高分子量組份——透明質(zhì)酸酶及磷醋酶A2。蜂毒肽具有很強的表面活性，直接破壞細菌的細胞膜，造成細胞的裂解致死。所以理論上講蜂毒肽具有廣譜性和速效性殺菌的優(yōu)良特性。與抗生素相比，蜂毒抗菌肽具有抗菌譜廣、低濃度下也可發(fā)揮作用、不易使微生物產(chǎn)生耐藥性以及可以合成不同于天然肽的類似物等優(yōu)勢。

一、蜂毒肽的分子基礎及構(gòu)效關系

蜂毒肽是由26個氨基酸組成的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，是一種線性肽，有四個二硫鍵連接，其相對分子量為2849（前體分子量7Kd），氨基酸的排列順序為：甘-異亮-甘-丙-纈-亮-賴-纈-亮-蘇-蘇-甘-亮-脯-丙-亮-異亮-絲-色-異亮-賴-精-賴-精-谷-谷。蜂毒肽的N末端起前20個氨基酸殘基主要是疏水的，而C末端的6個氨基酸殘基主要是親水的。在通常情況下，C-末端有4個氨基酸殘基攜帶正電荷，N-末端有2個氨基酸殘基攜帶正電荷，整個分子帶6個正電荷。分子中三個賴氨酸和二個精氨酸殘基的存在使蜂毒溶血肽成為強堿性肽，在中性水溶液中，其作為單體是以隨機的卷曲結(jié)構(gòu)存在的。蜂毒肽可以自我交聯(lián)，形成a螺旋的四聚體結(jié)構(gòu)。蜂毒肽的兩親性是膜結(jié)合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征，所以這個特性決定它既可以溶于水，又可以與膜自然結(jié)合，進而溶解細胞。蜂毒肽是種低分子量組份，其分子N端的疏水基團與細胞膜磷脂的結(jié)合、溶解了細胞膜，起到了細胞毒素作用。有學者研究證實，蜂毒肽在高濃度時，形成四聚體狀態(tài)，能夠比單體更有效的與細胞膜結(jié)合，形成了離子通道從而改變了細胞膜的通透性，引起Ca2+內(nèi)流，通過升高胞內(nèi)Ca2+濃度使細胞裂解，達到殺傷腫瘤細胞的目的。蜂毒肽的分子小，比起蓖麻毒素或喉毒蛋白等分子量較大的毒素，免疫原性低且不易產(chǎn)生過敏反應。對正常胞的毒性較低所以可較大劑量使用。蜂毒肽是迄今為止人類所知抗炎活性最強的物質(zhì)之一，它能夠抗菌抗病毒，可以抑制20多種革蘭氏陰性和陽性細菌的生長繁殖。除此之外，蜂毒肽還具有良好的抗腫瘤作用。它可以與其他抗菌肽組成雜交肽分子，使抗腫瘤作用明顯加強。探討蜂毒肽抑制腫瘤細胞的作用機理，對腫瘤的臨床治療具有重要的理論和應用價值。

二、蜂毒肽抗腫瘤作用的機制

1.直接將腫瘤細胞殺傷。①在細胞上直接形成孔隙溶解細胞。蜂毒肽等裂解肽，可以在細胞膜上形成孔隙，其機制與結(jié)合到膜表面和插入膜的結(jié)合肽的閥值水平有關。分析表明，蜂毒肽在兩性脂膜上不僅形成孔隙，也抑制孔隙的形成，這是兩個模式競爭反應的結(jié)果：直接插入到膜里面和平行結(jié)合到膜表面。蜂毒肽可以在毫秒之內(nèi)結(jié)合到脂膜上，采用α-螺旋結(jié)構(gòu)，垂直或平行結(jié)合到膜平面。蜂毒肽的直接插入會導致孔隙的形成，然而平行結(jié)合的蜂毒肽卻無效，并且平行結(jié)合的蜂毒肽還會阻止其他蜂毒肽的插入，從而防止形成孔隙。這些觀察結(jié)果引出了孔隙形成兩步模式的觀點：低濃度的蜂毒肽平行結(jié)合到膜上，濃度升高時轉(zhuǎn)變?yōu)榇怪睒?gòu)像，導致孔隙的形成。目前對從平行到垂直構(gòu)象的轉(zhuǎn)變還缺乏了解，主要因為陽離子蜂毒肽（pH=5）與脂質(zhì)的作用強烈（磷脂酰膽堿的分配系數(shù)為104～105mol/L），并且從平行轉(zhuǎn)換到垂直時所需能量時非常大。基于蜂毒肽對磷脂酰膽堿基團的高強親和力，人們普遍認為形成孔隙所需要的蜂毒肽濃度不是蜂毒肽的絕對濃度，而是相對濃度。然而，還沒有直接通過改脂質(zhì)的濃度和確定結(jié)合程度或自由蜂毒肽片段的方法測驗過。蜂毒肽潛在藥用價值引起了科學家的很大興趣，在所有裂解肽中，26個氨基酸殘基的蜂毒肽是目前研究最好的。②激活腫瘤細胞上的磷脂酶從而使細胞死亡。蜂毒肽可以根據(jù)膜濃度的比例，抑制或激活磷脂酶的活性。低濃度的蜂毒肽抑制PLA2，當濃度≥1μmol/L時，則激活PLA2。通過在人血清中蜂毒肽降解大腸桿菌釋放脂肪酸的實驗發(fā)現(xiàn)，血清中存在一種對熱和胰島素敏感的因子，這種因子對蜂毒肽激活磷脂酶的過程有促進作用，同時也可激活磷脂酶D。蜂毒肽與腫瘤細胞作用后，降解掉腫瘤細胞膜上的Band-2蛋白的一個亞型。Band-3蛋白被降解為兩部分。Band-3蛋白是構(gòu)成腫瘤細胞膜跨膜蛋白的主要組成部分，Band-3蛋白不但構(gòu)成細胞膜上的離子通道，還具有抗菌抗病毒以及防止蛋白水解酶水解膜蛋白的作用。Band-3蛋白水解后，離子無法進出細胞膜從而導致細胞代謝功能的失調(diào)，細胞的正常生命活動受阻，從而導致細胞的死亡。由于膜保護劑被破壞，肽分子間接激活了膜上或環(huán)境中的蛋白酶，并與Band-2結(jié)合，使磷酸化作用和Ca2+-ATP酶活性受到抑制，且影響B(tài)and-2蛋白的膜收縮作用和膜骨架功能，從而導致整個膜的功能失常。

2.誘導細胞啟動凋亡程序。許多化學藥物可以通過誘導腫瘤細胞啟動凋亡程序使細胞自動凋亡，從而達到抗腫瘤的目的。能否誘導細胞啟動凋亡程序是篩選抗癌藥物的一個標準。有實驗顯示，蜂毒肽在體外能夠抑制人胃癌細胞株SCG-7901，可以將胃癌細胞阻滯在G2/M期，同時誘導癌細胞啟動凋亡程序。有人通過建立人肝癌裸鼠移植瘤模型進一步探討蜂毒肽的體外抗腫瘤作用。認為，蜂毒肽對提高移植瘤的抑制率具有顯著作用，移植瘤的體積與藥用時間的長短，有要的劑量的多少呈正相關。細胞凋亡是調(diào)節(jié)腫瘤生長的一個重要因素，腫瘤之所以產(chǎn)生，是細胞分化、增殖、凋亡異常的結(jié)果。蜂毒肽對肝臟腫瘤細胞Hep-2裸鼠皮下移植瘤的生長具有強烈的抑制作用，可以極大的增強機體的免疫功能，因此誘導腫瘤細胞啟動凋亡程序可能是蜂毒肽抗腫瘤的機制之一。蜂毒肽能夠激活磷脂酶A2，激活的磷脂酶A2能夠使線粒體膜和溶酶體膜喪失穩(wěn)定性，從而導致線粒體和溶酶體破裂繼而將細胞殺死。蜂毒肽還可以將線粒體膜內(nèi)的結(jié)合蛋白質(zhì)釋放出來，這一步在早期引起細胞凋亡的眾多途徑中是關鍵一步。蜂毒肽還可以強烈抑制鈉鉀泵的功能，使細胞喪失正常的膜電位，導致細胞膜功能失常。AFP促進腫瘤細胞增殖的重要的內(nèi)源性物質(zhì)之一，然而它卻抑制免疫細胞的DNA合成和細胞的分裂。有實驗證明，AFP與蜂毒肽起拮抗作用，起到促進腫瘤細胞生長，抑制腫瘤細胞凋亡的作用。種種研究結(jié)果表明AFP基因的異常表達是維持肝癌細胞惡性生長的分子基礎，利用AFP轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列驅(qū)動治療基因表達是肝癌靶向基因治療的主要方法之一。

3.影響腫瘤細胞的生物學行為。腫瘤細胞與宿主細胞、細胞外基質(zhì)經(jīng)過一系列多步驟、復雜的相互作用就可能形成惡性腫瘤的侵襲。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移也與粘附分子有關。在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的整個過程都伴有細胞的脫落與聚合、粘附與去粘附。有研究顯示蜂毒肽基因轉(zhuǎn)染可以抑制CD54分子的表達，通過改變腫瘤的生物學行為達到抗腫瘤的效果。另有研究顯示蜂毒肽預防肝癌細胞轉(zhuǎn)移可能與其抑制Rac1信號通路有關。有研究利用腺病毒作為載體將蜂毒肽基因?qū)敫闻K腫瘤細胞后整合到肝癌細胞的基因組，使肝癌細胞的生長明顯受到抑制。因為缺少蜂毒肽抗體，還不能從蛋白質(zhì)水平確定蜂毒肽基因的表達。但是病毒Ad-rAFP-Mel顯著抑制HepG2細胞生長，且有量效關系。

4.改變腫瘤的生存環(huán)境。原發(fā)性腫瘤若想在機體內(nèi)生長和繁殖，必須要在于案發(fā)地組織周圍形成新的血管，供給營養(yǎng)物質(zhì)，并且這些血管也為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供了有利條件。下調(diào)VEGF和β-FGF的表達，抑制腫瘤周圍血管的生成可能會成為抗腫瘤的一種手段。有學者觀察了蜂毒肽對骨肉瘤UNR-106細胞裸鼠移植瘤的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜂毒肽治療組的新生血管數(shù)量明顯少于對照組，說明蜂毒肽能夠抑制新生血管的形成。同時還有研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽對雞胚絨毛尿囊膜的血管形成也有明顯的抑制作用。因而有學者提出蜂毒肽對腫瘤的抑制作用可能與改變了腫瘤的生長環(huán)境有關——抑制周圍血管的生成，是腫瘤細胞由于缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的供應而死亡，并且可以降低腫瘤細胞的侵襲能力。

三、蜂毒肽抗腫瘤的臨床應用

1.組成雜合肽。蜂毒肽與天然抗菌肽形成的雜合肽不但具有很強的抗菌作用，而且在抗腫瘤方面也有很好的療效。有學者利用肺癌細胞系對雜合肽的結(jié)構(gòu)同抗菌作用和抗腫瘤的效果的關系進行研究時發(fā)現(xiàn)，當肽的18和19位殘基均是堿性的K，16位殘基是疏水的L或V時，抗腫瘤作用更強；第12位殘基與溶血作用有關而與抗腫瘤作用無關；第4位的P使堿性程度增加從而增強了溶血作用，但抗腫瘤作用無明顯改變。

2.將蜂毒肽制成免疫毒素。在免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的過程中，T淋巴細胞執(zhí)行特異性細胞免疫的功能。由于殺傷性T細胞核抑制性體細胞的抗原決定簇相同，遲發(fā)型過敏發(fā)應T細胞和輔助性T細胞稱為CD4，Th細胞和Tdth細胞稱為CD8，通過測量經(jīng)蜂毒肽治療后的CD4和CD8的變化，可以測量出蜂毒肽分子對機體產(chǎn)生的影響。在一定程度上T細胞亞群可以作為免疫系統(tǒng)平衡標志的，CD4/CD8的比值在免疫學上常用來衡量免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定程度。蜂毒肽與T淋巴細胞亞群的作用是雙向的，無論向哪個方向偏離，都會有回歸正常范圍的趨勢。利用蜂毒肽治療時，CD4細胞數(shù)量要比CD8細胞升高的早，但是經(jīng)過一段時間的調(diào)整后，兩者又恢復平衡狀態(tài)，但是這種短暫地失衡對患者的影響不大。一直以來，蜂毒肽被認為是理想的免疫調(diào)節(jié)藥物。但從療效來看，CD4和CD8的變化范圍越大，治療的效果越顯著。蜂毒肽對CD4/CD8影響，就是蜂毒肽雙向免疫調(diào)節(jié)作用的證明。利用單克隆抗體的特異性，將蜂毒肽帶到病灶以殺傷腫瘤細胞。將蜂毒肽分子與單克隆抗體通過化學鍵連接到一起，這樣組成的偶聯(lián)物既可以保留單克隆抗體對腫瘤細胞的特異性識別，又保留了蜂毒肽對腫瘤細胞的強烈的殺傷作用，降低了蜂毒肽對正常機體細胞的破壞力。將編碼蜂毒肽的基因片段和編碼抗體的基因片段構(gòu)建成復合基因，然后將構(gòu)建的符合基因?qū)氪竽c桿菌并整合到其基因組內(nèi)予以表達。表達的產(chǎn)物克服了蜂毒肽對機體的非特異性殺傷，又可以借助單克隆抗體的精確定位作用大大提高蜂毒肽對腫瘤細胞的殺傷力。有人通過化學合成的方法合成蜂毒肽，去掉了蜂毒肽C端的4個氨基酸，使其能夠形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，增強其水溶性，提高其溶血能力。

3.蜂毒肽類似物的研究。把天然蜂毒肽基因整合到pGEX-4T-2載體中，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pDEX-AccM的BL21。經(jīng)誘導表達的產(chǎn)物蛋白占工程菌蛋白的15.2%，并且具有水溶性的占40%，蛋白的純化提取均很方便。蜂毒肽基因雖為真核基因，但是由于其結(jié)構(gòu)簡單，含脫氧核苷酸的數(shù)目少，翻譯的產(chǎn)物不用糖基化等修飾，在原核生物中表達的產(chǎn)物也具有很高的活性。

4.蜂毒肽基因直接導入到腫瘤細胞內(nèi)。我們可以將蜂毒肽基因直接導入腫瘤細胞，讓其表達的產(chǎn)物持續(xù)不斷的對病灶給藥，以達到殺死腫瘤細胞的作用。有人將蜂毒肽基因整合到腺病毒的基因組上，然后讓重組的腺病毒侵染肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)抑制肝臟腫瘤的效果明顯。

四、蜂毒肽作為抗腫瘤藥物存在的問題及解決的方法

蜂毒的成分十分復雜，各成分作用也不一樣，如若使用不當，可引起過敏性水腫、過敏性休克等副作用。人工合成蜂毒肽單體的工藝煩瑣，成本太高。因此提純蜂毒肽的研究意義重大。傳統(tǒng)提取蜂毒肽的方法是采用凝膠柱色譜加離子交換柱進行梯度洗脫，制得的蜂毒素組分中常含有磷脂酶A2等雜質(zhì)，且梯度洗脫操作較煩瑣。現(xiàn)代工藝選用單一流動相，采用多種規(guī)格的分離凝膠柱分3步進行分離純化，這種工藝的洗脫速度適中，純化過程較為省時，利用高效液相色譜對分離產(chǎn)物進行測定后發(fā)現(xiàn)，這種工藝較之傳統(tǒng)工藝分離所得到的蜂毒素的純度更高。由于蜂毒肽毒性較大，當用量過大時會對正常的機體組織造成一定的傷害，尤其是蜂毒肽的溶血作用，使用不當可能造成嚴重后果。這些不利因素限制的蜂毒肽的在臨床應用上的推廣。為了消除蜂毒肽的這些弊端，達到增效減毒的目的，有人將蜂毒肽溶于泊洛沙姆407中制成緩釋劑。這種方法制成的緩釋劑經(jīng)試驗證明其毒性明顯低于單純的蜂毒肽，經(jīng)緩蝕劑處理過的腫瘤細胞的生長受到明顯的抑制，腫瘤組織廣泛壞死，處理后的腫瘤組織平均生存期延長，綜合治療作用優(yōu)于單純的蜂毒肽。這表明蜂毒肽緩蝕劑延長了蜂毒肽的作用時間，增強了蜂毒肽的抗腫瘤效果，并且單位時間內(nèi)作用于機體的藥量減少，降低了蜂毒肽對機體正常組織的毒害作用。除此之外，有人采用將蜂毒肽制備成蜂毒肽-聚乳酸羥乙酸微球，然后將其導入大鼠移植性肝癌部位，藥物在腫瘤部位局部緩慢釋放，使病灶部位的藥物濃度高，但全身濃度卻相對較低，這樣不但增強了藥物的對腫瘤的殺傷力，也起到了減毒的作用，效果明顯優(yōu)于單純的蜂毒肽。

[1]李紹祥，凌昌全，劉新垣.攜蜂毒素基因腺病毒感染對HepG2細胞CD54表達的影響[J].第一軍醫(yī)大學學報，2003，23（4）：300.

[2]劉嶺，凌昌全，黃雪強.蜂毒素的純化方法及體外抗腫瘤作用研究[J].中國生化藥物雜志，2003，24（4）：163-166.

R979.1

A

1674-9324（2014）29-0140-03

河北省自然科學基金資助項目（C2012208069）；河北科技大學創(chuàng)新基金資助課題。

李迎濤，碩士研究生，研究方向：分子藥理學。

王莉，博士，副教授，研究方向：分子藥理學。