細胞支原體巢式PCR檢測方法的建立及應用

黃海軍+高其雙+彭霞等

摘要：動物生物制品生產過程中細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。細胞支原體污染可顯著影響生產用細胞的培養及生物功能的發揮，最終影響生物制品的生產，給生物制品企業造成巨大損失，建立高效、快速、敏感度高的檢測方法十分必要。建立了一種支原體巢式PCR檢測方法，該方法高效、快速、靈敏，可以最大限度降低假陰性和假陽性結果的出現。該方法的建立對培養細胞、動物疫苗等生物制品企業的檢測標準化管理有一定的借鑒意義。

關鍵詞：支原體；細胞培養；巢式PCR；生物制品

中圖分類號：S858.28；Q95 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0690-03

細胞培養過程中支原體污染主要來源于所使用的動物源的一些培養材料，如血清、已被支原體污染的細胞株（系）或者是經操作人員傳播。污染培養細胞的支原體一般有寄生于人、牛、豬或狗的少數幾種類型。細胞培養液中支原體的濃度可達1×107個/mL，而不管是肉眼觀察還是普通顯微鏡下觀察，受支原體污染的細胞狀態并無明顯變化[1]。但是，越來越多的研究表明，支原體感染發生后能改變細胞的DNA、RNA及蛋白表達，使研究結果的真實性和可靠性大大下降[2，3]。由于競爭營養及支原體有毒的代謝產物，支原體污染可顯著影響生產用細胞的培養及相應生物學功能的發揮，影響生物制品的質量。細胞被支原體污染長期困擾著疫苗（特別是生產弱毒苗）的生產企業，增加了企業生產、投資的風險，特別是在競爭日益激烈的當代社會，這種風險對疫苗生產企業來說通常是致命的。因此，建立一種高效、快速、敏感度高的檢測方法十分必要。

目前，普遍公認的細胞支原體污染檢測方法為分離培養法，該方法耗時、敏感性低，甚至可能出現二次污染，影響結果的判斷。隨著分子生物學的發展，PCR方法已經成為一種常用的有效檢測培養困難和抗原性復雜的微生物的方法[4，5]。本研究建立了一種細胞支原體巢式PCR檢測方法，最大限度降低了假陰性和假陽性結果的出現，以期為完善細胞支原體的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）濟南系強毒（菌號CVCC354）購自中國獸醫藥品監察所。

供試試劑與儀器：Taq DNA polymerase（2.5 U/μL）、10×PCR Buffer、dNTP（2.5 mmol/L）、DNA凝膠回收與純化試劑盒購自武漢天源生物技術公司，對比用支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）由以色列BI公司生產。9700型PCR 儀由美國ABI公司生產。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 根據12種常見類型支原體（M. hyorhinis、M. orale、M. hyopneumoniae、M. arginini、

1.2.2 PCR檢測方法的建立

1）陽性PCR模板的制備：將豬肺炎支原體培養液沸水水浴10 min，再3 000 r/min離心10 min，取上清液作為支原體陽性PCR擴增的陽性模板。

2）陽性支原體的檢測：第一輪PCR反應體系25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，陽性引物Myc-F1和Myc-R1（10 μmol/L）各0.5 μL，陽性模板1 μL，Taq DNA 酶（2.5 U/μL） 0.25 μL，加ddH2O至25 μL。同時以ddH2O為陰性對照。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃ 10 min。第一輪PCR反應結束后，取1 μL PCR產物作為第二輪PCR反應的模板，反應體系其他成分及反應條件同第一輪PCR。分別取第一輪和第二輪PCR反應產物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后對目的片段進行純化，作為PCR陽性模板備用。

3）陽性Mhp模板稀釋倍數的確定：按1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6濃度梯度稀釋Mhp陽性產物，固定體系其他成分不變進行PCR反應。反應結束后，取10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇最適濃度作為Mhp陽性標準品。

4）反應條件的優化：Taq DNA 酶最適使用量的確定，按最適引物濃度，優化Taq DNA 酶 （2.5 U/μL）的使用量，分別為0.125、0.25、0.5 μL；dNTP最適使用量的確定，反應體系中dNTP（2.5 mmol/L）的使用量分別為1、2、3 μL。反應體系中其他成分和反應條件均不改變。反應結束后，取PCR反應產物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定最適濃度配比。

1.2.3 應用 從武漢某疫苗生產車間隨機選取3個批次共10個疑似支原體污染的樣本，收集細胞培養上清液。3 000 r/min離心5 min，沉淀培養液中殘留的細胞，然后取上清液5 μL備用。按本研究建立的巢式PCR反應體系及條件，對各樣本的兩種平行樣品進行檢測。并將結果與EZ-PCR Mycoplasma 檢測結果進行比對。將兩種方法檢測為陽性的樣品依次進行10-1～10-4梯度稀釋，分別用本研究建立的方法和支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）進行檢測，比較兩者的靈敏度。將本方法診斷陽性的樣品進行病原培養，驗證其檢測準確性。

2 結果與分析

2.1 陽性標準品的建立

經PCR擴增得到654 bp的Mhp基因片段，與預期結果相符（圖1）。測定回收的Mhp陽性模板濃度為13.6 μg/mL，結果表明， Mhp陽性模板的稀釋倍數為1×10-5 時，條帶清晰（圖1），考慮到檢測條件及產物的穩定性，將標準品濃度定為2×10-4 μg/mL，即0.2 ng/mL。

2.2 巢式PCR反應體系的優化

在反應條件及體系其他成分不變的同時，分別對Taq DNA酶和dNTP使用量進行優化，并根據第一次和第二次PCR擴增結果，確定反應體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測方法的應用

用所建立的巢式PCR檢測方法對收集的10個疑似支原體污染樣品進行檢測，第一輪PCR擴增結果和第二輪擴增結果分別見圖2和圖3。

將PCR產物回收送上海生工生物工程有限公司測序，并與Genbank中登錄的相關序列進行比對，結果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽性，7號樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽性，4號樣品和8號樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽性。該結果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測結果完全一致。

將4個檢測為陽性的樣品依次進行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進行檢測，結果表明，2種方法均可檢測到稀釋10-3倍的模板，符合率達100%。

3 小結與討論

支原體是一種介于細菌和病毒之間的能獨立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無細胞壁故具有可塑性，可通過濾菌器，對于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細胞培養污染的一個重要因素[6]。動物疫苗生產過程中細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。已有許多調查及研究顯示，美國和歐洲正在使用的細胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國微生物和培養細胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內細胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國內使用的細胞系中的支原體的污染更為嚴重，使得生物制品企業面臨的形勢極為嚴峻[1]。

支原體感染細胞后，并不引起細胞形態及功能的急性改變，不易被察覺，但是細胞支原體污染卻給疫苗生產帶來致命打擊。因此，在疫苗生產早期對細胞支原體污染進行監測具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發現，PCR檢測支原體的引物選用16S rRNA序列保守區，難以在保證特異性強的情況下擴增出所有常見支原體污染種別的DNA，導致假陰性結果的出現。本研究根據常見支原體16S～23S間隔區種別特異性序列，設計2對用于巢式擴增支原體的引物，可以準確檢測12種常見支原體，這12種常見支原體代表了98%以上的細胞支原體污染源。本方法檢測整個過程耗時不超過6 h，且設置了陰性對照和陽性對照標準品，避免了假陰性和假陽性，檢測結果與以色列BI公司支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統培養法鑒定結果相一致，也證實了其檢測的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細胞培養、動物疫苗等生物制品企業的檢測標準化管理中得到廣泛應用。

參考文獻：

[1] 劉玉琴.體外培養細胞工作中支原體污染及對策[J].中華病理學雜志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

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[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.

2.2 巢式PCR反應體系的優化

在反應條件及體系其他成分不變的同時，分別對Taq DNA酶和dNTP使用量進行優化，并根據第一次和第二次PCR擴增結果，確定反應體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測方法的應用

用所建立的巢式PCR檢測方法對收集的10個疑似支原體污染樣品進行檢測，第一輪PCR擴增結果和第二輪擴增結果分別見圖2和圖3。

將PCR產物回收送上海生工生物工程有限公司測序，并與Genbank中登錄的相關序列進行比對，結果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽性，7號樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽性，4號樣品和8號樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽性。該結果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測結果完全一致。

將4個檢測為陽性的樣品依次進行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進行檢測，結果表明，2種方法均可檢測到稀釋10-3倍的模板，符合率達100%。

3 小結與討論

支原體是一種介于細菌和病毒之間的能獨立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無細胞壁故具有可塑性，可通過濾菌器，對于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細胞培養污染的一個重要因素[6]。動物疫苗生產過程中細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。已有許多調查及研究顯示，美國和歐洲正在使用的細胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國微生物和培養細胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內細胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國內使用的細胞系中的支原體的污染更為嚴重，使得生物制品企業面臨的形勢極為嚴峻[1]。

支原體感染細胞后，并不引起細胞形態及功能的急性改變，不易被察覺，但是細胞支原體污染卻給疫苗生產帶來致命打擊。因此，在疫苗生產早期對細胞支原體污染進行監測具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發現，PCR檢測支原體的引物選用16S rRNA序列保守區，難以在保證特異性強的情況下擴增出所有常見支原體污染種別的DNA，導致假陰性結果的出現。本研究根據常見支原體16S～23S間隔區種別特異性序列，設計2對用于巢式擴增支原體的引物，可以準確檢測12種常見支原體，這12種常見支原體代表了98%以上的細胞支原體污染源。本方法檢測整個過程耗時不超過6 h，且設置了陰性對照和陽性對照標準品，避免了假陰性和假陽性，檢測結果與以色列BI公司支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統培養法鑒定結果相一致，也證實了其檢測的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細胞培養、動物疫苗等生物制品企業的檢測標準化管理中得到廣泛應用。

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[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.

2.2 巢式PCR反應體系的優化

在反應條件及體系其他成分不變的同時，分別對Taq DNA酶和dNTP使用量進行優化，并根據第一次和第二次PCR擴增結果，確定反應體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測方法的應用

用所建立的巢式PCR檢測方法對收集的10個疑似支原體污染樣品進行檢測，第一輪PCR擴增結果和第二輪擴增結果分別見圖2和圖3。

將PCR產物回收送上海生工生物工程有限公司測序，并與Genbank中登錄的相關序列進行比對，結果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽性，7號樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽性，4號樣品和8號樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽性。該結果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測結果完全一致。

將4個檢測為陽性的樣品依次進行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進行檢測，結果表明，2種方法均可檢測到稀釋10-3倍的模板，符合率達100%。

3 小結與討論

支原體是一種介于細菌和病毒之間的能獨立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無細胞壁故具有可塑性，可通過濾菌器，對于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細胞培養污染的一個重要因素[6]。動物疫苗生產過程中細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。已有許多調查及研究顯示，美國和歐洲正在使用的細胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國微生物和培養細胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內細胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國內使用的細胞系中的支原體的污染更為嚴重，使得生物制品企業面臨的形勢極為嚴峻[1]。

支原體感染細胞后，并不引起細胞形態及功能的急性改變，不易被察覺，但是細胞支原體污染卻給疫苗生產帶來致命打擊。因此，在疫苗生產早期對細胞支原體污染進行監測具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發現，PCR檢測支原體的引物選用16S rRNA序列保守區，難以在保證特異性強的情況下擴增出所有常見支原體污染種別的DNA，導致假陰性結果的出現。本研究根據常見支原體16S～23S間隔區種別特異性序列，設計2對用于巢式擴增支原體的引物，可以準確檢測12種常見支原體，這12種常見支原體代表了98%以上的細胞支原體污染源。本方法檢測整個過程耗時不超過6 h，且設置了陰性對照和陽性對照標準品，避免了假陰性和假陽性，檢測結果與以色列BI公司支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統培養法鑒定結果相一致，也證實了其檢測的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細胞培養、動物疫苗等生物制品企業的檢測標準化管理中得到廣泛應用。

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[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

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