魔芋內生拮抗菌的定殖研究

程海麗+陳磊+樂超銀

摘要：采用抗魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病的內生芽孢桿菌BS-8發酵液灌根魔芋植株，定期測定該內生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況。根據該內生菌16S rRNA特異性保守區域設計引物，定期4次采樣，提取魔芋葉片DNA，通過SYBR Green I實時熒光定量PCR法檢測該內生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況。結果表明，經內生拮抗菌灌根培養的魔芋葉片中芽孢桿菌數量均明顯大于對照，該內生芽孢桿菌能大量定殖在魔芋葉片中。

關鍵詞：魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病；內生拮抗菌；SYBR Green I實時熒光定量PCR

中圖分類號：S632.9；TQ458 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0613-04

魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌（Erwonia carotovora var. Carotovora）引起的一種細菌性病害[1]。該病原菌致病機理為病原菌分泌果膠酶，消解細胞中間層，使組織潰爛，吸引其他腐敗細菌寄生，分解細胞蛋白胨，產生吲哚[2]。可危害所有十字花科蔬菜，且可交替傳染。在流行年份損失可達50%～60%，甚至絕收，因此對其進行防治十分必要[3]。

近年來，生物防治已成為國內外學者的研究熱點[4]。生物防治有利于人畜安全及環境保護，它不僅成本低廉，且兼防兼治，可增產增收，是一種無公害植保新技術，倍受人們青睞[5]。植物內生菌是指在植物生長的一定或全部階段生活在植物體內、但不表現出外在性狀的一類微生物，通常存在于細胞間隙[6，7]。植物內生菌作為生防因子的優勢主要表現在它能定殖于植物體內，相對于其他環境微生物而言，避免了多種外界壓力的干擾，更有利于發揮生防效果。關于魔芋內生菌定殖體內的生防效果研究很少，因此，篩選出具有拮抗魔芋軟腐病的微生物是目前防治軟腐病的有效途徑。

實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR）技術是通過在反應體系中添加熒光染料或熒光標記特異性探針，在PCR反應過程中對擴增產物進行實時在線監控，通過收集的熒光信號強弱進行定性或定量檢測和分析[8-10]。與常規PCR相比，熒光定量PCR能準確確定初始模板的拷貝數或濃度，靈敏度高，其擴增產物無需進行瓊脂糖凝膠電泳，大大提高了試驗效率。利用實時熒光定量PCR技術能對植物樣品進行定性和定量檢測，主要用于研究植物體內有益微生物及病原菌的定量檢測、基因拷貝數檢測、目的基因表達水平差異檢測等，檢測范圍為101～1010拷貝數。本研究利用實時熒光定量PCR技術檢測內生拮抗菌在魔芋植株中的定殖情況，以期為研究新的魔芋生防制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試灌根用菌為魔芋內生拮抗菌芽孢桿菌BS-8，由三峽大學生物技術研究中心于2011年分離鑒定并保存，經鑒定該菌抗魔芋軟腐病。培養基為LB培養基[11]。

1.2 方法

1.2.1 發酵液的制備 將BS-8菌種涂布于LB固體培養基的平板上，置于37 ℃培養箱中過夜培養。挑取一定體積的菌落置于含250 mL LB液體培養基的錐形瓶中，封口后放入搖床，37 ℃振蕩培養48 h。檢測發酵液OD值，使其OD值為0.6，以備后面灌根用。

1.2.2 DNA的提取 挑取大小均勻、質量約10 g的種芋播種于花盆中，待出苗后，以每盆100 mL內生拮抗菌發酵液澆灌于魔芋植株根部，以澆灌自來水的作為空白對照，每個處理20個重復。待魔芋灌根處理后每隔15 d采1次樣，共采樣4次，樣品和空白對照每次做3次重復。DNA的提取采用CTAB法[12]。

1.2.3 引物設計與PCR檢測 將該內生拮抗菌16S rRNA序列與同屬菌株進行比對，尋找特異性區域，根據該區域設計引物。上游引物為FQ-5 5′-ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAG-3′和下游引物為FQ-3 5′-TCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCC-3′，PCR擴增產物為147 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1）構建質粒標準品。以BS-8菌株的DNA為模板進行PCR擴增，反應體系（25 μL）為DNA模板 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Primer 1和Primer 2各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL。反應條件為94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃保溫10 min。擴增產物經電泳檢測，割膠回收后連接T載體，并將陽性轉化子菌液送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

2）標準品和待測樣品的實時熒光定量PCR。反應體系（25 μL）：DNA模板2.0 μL，Primer 1和Primer 2各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 12.5 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，78 ℃ 孵育1 s，共39個循環；72 ℃保溫10 min。反應結束后，對PCR產物進行檢測，溫度從60 ℃上升到95.5 ℃，直至PCR產物全部解鏈，溫度上升的幅度為0.3 ℃/s，每10 s檢測一次熒光信號，繪制PCR產物的溶解曲線、擴增曲線圖和標準曲線。

3）SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR標準曲線的繪制。以純化后的質粒作為標準品，用核酸蛋白測定儀檢測提取的質粒濃度，計算其拷貝數[13]。

將質粒標準品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個濃度梯度，拷貝數范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個濃度的質粒DNA進行熒光實時定量PCR，制作標準曲線，每個濃度3次重復，同時以不加模板作為陰性對照。反應結束后，自動生成溶解曲線，并根據不同濃度標準DNA的Ct值及其起始拷貝數的log值繪制標準曲線，建立標準曲線的線性范圍，構建絕對定量。

4）內生拮抗菌BS-8在魔芋體內定殖情況的檢測。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進行熒光定量PCR檢測，反應體系和條件同上，反應結束后，將每個模板對應的Ct值代入標準曲線的方程中，計算內生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數量。

2 結果與分析

2.1 常規PCR檢測內生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區域序列設計引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進行PCR擴增，同時以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對照，2%瓊脂糖電泳檢測擴增產物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產物除第三次外均無此條帶。結果表明，常規PCR檢測到經芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內。該內生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達。

2.2 質粒標準品的構建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進行PCR擴增，結果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預期的條帶大小一致，PCR產物特異性強、條帶清晰，沒有明顯的二聚體產生。將擴增的目標片段與T載體連接，測序結果得到序列大小為147 bp。

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線的繪制

利用構建好的標準質粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進行實時熒光定量PCR，溶解曲線、擴增曲線和標準曲線依次見圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說明反應過程中沒有其他非靶標產物產生，引物特異性強，產物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準確。

由圖5可知，標準曲線的斜率為-3.216 66，說明反應的Ct值與質粒濃度的拷貝數log值成反比，實時熒光定量PCR標準曲線的R2=0.980 82，說明不同拷貝數與其對應的Ct值具有很高的相關性，準確性好，能用于后續進一步的熒光定量分析。

2.4 內生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進行實時熒光定量PCR，熒光擴增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應的Ct值代入標準曲線方程中，計算芽胞桿菌DNA拷貝數的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數量。

2.5 檢測結果

由表1可知，利用Ct值代入標準曲線方程中計算出的拷貝數范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標準曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數量均明顯大于空白處理。

3 結論

本試驗通過實時熒光定量PCR檢測了魔芋內生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數據不能說明該內生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關系，因此，需要后面繼續進行研究，檢測該內生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關系。另外，該定量方法并不能說明所檢測的內生菌數量全部是芽孢桿菌BS-8，因為魔芋葉片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說熒光定量PCR檢測的定殖芽孢桿菌含量并不準確，因為熒光定量PCR并不能進行物種分類，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會被檢測到，單純的16S rRNA引物并不能用來對特異的某種微生物進行準確定量分析，尤其在比較復雜的微生物體中，如果要進行更精確的分析，應采用探針法進行研究。

參考文獻：

[1] 李雅華，咸洪泉，李樹文，等.拮抗胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌的放線菌的分離和篩選[J].青島農業大學學報（自然科學版），2009， 26（2）：143-146.

[2] 翁祖信.蔬菜病蟲害診斷與防治[M].天津：天津科學技術出版社，1994.363-365.

[3] 陳 麗，安德榮，張鈺銘.防治白菜軟腐病的藥劑篩選[J].西北農業學報，2005，14（2）：105-107.

[4] 薛 婷，李喜宏，陳 麗，等.蒜苔采后灰霉病害及生防拮抗菌的篩選研究[J].食品科學，2006，27（6）：220-222.

[5] 姜 鈺，董懷玉，徐秀德，等.放線菌在植病生防中的研究進展[J].雜糧作物，2005，25（5）：329-331.

[6] SCHMEDA-HIRSCHMANN G，HORMAZABAL E，RODRIGUEZ J A，et al.Cycloaspeptide A and pseurotin A from the endophytic fungus Penicillium janczewskii[J]. Z Naturforsch，2008，63（5/6）：383-388.

[7] AZEVEDO J L，ARAUJO W L.Diversity and applications of endophytic fungi isolated from tropical plant[A]. In Fungi：Multifaceted Microbes[C]. New Delhi： Anamaya Publishers，2007. 189-207.

[8] KUBISTA M， ANDRADE J M，BENGTSSON M，et al. The real-time polymerase chain reaction[J]. Molecular Aspects of Medicine，2006，27（2/3）：95-125.

[9] 韓彩霞，趙德明，吳長德，等.用實時熒光定量RT-PCR方法定量綿羊PrP基因的表達[J].中國農業大學學報，2006，11（2）：61-64.

[10] 歐陽松應，楊 冬，歐陽紅生，等.實時熒光定量PCR技術及其應用[J].生命的化學，2004，24（1）：74-76.

[11] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1999.

[12] 申煌煊，李 剛.分子生物學實驗方法與技巧[M].廣州：中山大學出版社，2010.134-135.

[13] 馮 興.益生芽孢桿菌PAS38在肉雞腸道中的消長規律及對腸道菌群調節作用研究[D].四川雅安：四川農業大學，2009.

將質粒標準品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個濃度梯度，拷貝數范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個濃度的質粒DNA進行熒光實時定量PCR，制作標準曲線，每個濃度3次重復，同時以不加模板作為陰性對照。反應結束后，自動生成溶解曲線，并根據不同濃度標準DNA的Ct值及其起始拷貝數的log值繪制標準曲線，建立標準曲線的線性范圍，構建絕對定量。

4）內生拮抗菌BS-8在魔芋體內定殖情況的檢測。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進行熒光定量PCR檢測，反應體系和條件同上，反應結束后，將每個模板對應的Ct值代入標準曲線的方程中，計算內生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數量。

2 結果與分析

2.1 常規PCR檢測內生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區域序列設計引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進行PCR擴增，同時以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對照，2%瓊脂糖電泳檢測擴增產物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產物除第三次外均無此條帶。結果表明，常規PCR檢測到經芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內。該內生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達。

2.2 質粒標準品的構建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進行PCR擴增，結果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預期的條帶大小一致，PCR產物特異性強、條帶清晰，沒有明顯的二聚體產生。將擴增的目標片段與T載體連接，測序結果得到序列大小為147 bp。

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線的繪制

利用構建好的標準質粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進行實時熒光定量PCR，溶解曲線、擴增曲線和標準曲線依次見圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說明反應過程中沒有其他非靶標產物產生，引物特異性強，產物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準確。

由圖5可知，標準曲線的斜率為-3.216 66，說明反應的Ct值與質粒濃度的拷貝數log值成反比，實時熒光定量PCR標準曲線的R2=0.980 82，說明不同拷貝數與其對應的Ct值具有很高的相關性，準確性好，能用于后續進一步的熒光定量分析。

2.4 內生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進行實時熒光定量PCR，熒光擴增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應的Ct值代入標準曲線方程中，計算芽胞桿菌DNA拷貝數的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數量。

2.5 檢測結果

由表1可知，利用Ct值代入標準曲線方程中計算出的拷貝數范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標準曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數量均明顯大于空白處理。

3 結論

本試驗通過實時熒光定量PCR檢測了魔芋內生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數據不能說明該內生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關系，因此，需要后面繼續進行研究，檢測該內生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關系。另外，該定量方法并不能說明所檢測的內生菌數量全部是芽孢桿菌BS-8，因為魔芋葉片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說熒光定量PCR檢測的定殖芽孢桿菌含量并不準確，因為熒光定量PCR并不能進行物種分類，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會被檢測到，單純的16S rRNA引物并不能用來對特異的某種微生物進行準確定量分析，尤其在比較復雜的微生物體中，如果要進行更精確的分析，應采用探針法進行研究。

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[10] 歐陽松應，楊 冬，歐陽紅生，等.實時熒光定量PCR技術及其應用[J].生命的化學，2004，24（1）：74-76.

[11] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1999.

[12] 申煌煊，李 剛.分子生物學實驗方法與技巧[M].廣州：中山大學出版社，2010.134-135.

[13] 馮 興.益生芽孢桿菌PAS38在肉雞腸道中的消長規律及對腸道菌群調節作用研究[D].四川雅安：四川農業大學，2009.

將質粒標準品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個濃度梯度，拷貝數范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個濃度的質粒DNA進行熒光實時定量PCR，制作標準曲線，每個濃度3次重復，同時以不加模板作為陰性對照。反應結束后，自動生成溶解曲線，并根據不同濃度標準DNA的Ct值及其起始拷貝數的log值繪制標準曲線，建立標準曲線的線性范圍，構建絕對定量。

4）內生拮抗菌BS-8在魔芋體內定殖情況的檢測。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進行熒光定量PCR檢測，反應體系和條件同上，反應結束后，將每個模板對應的Ct值代入標準曲線的方程中，計算內生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數量。

2 結果與分析

2.1 常規PCR檢測內生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區域序列設計引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進行PCR擴增，同時以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對照，2%瓊脂糖電泳檢測擴增產物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產物除第三次外均無此條帶。結果表明，常規PCR檢測到經芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內。該內生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達。

2.2 質粒標準品的構建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進行PCR擴增，結果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預期的條帶大小一致，PCR產物特異性強、條帶清晰，沒有明顯的二聚體產生。將擴增的目標片段與T載體連接，測序結果得到序列大小為147 bp。

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線的繪制

利用構建好的標準質粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進行實時熒光定量PCR，溶解曲線、擴增曲線和標準曲線依次見圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說明反應過程中沒有其他非靶標產物產生，引物特異性強，產物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準確。

由圖5可知，標準曲線的斜率為-3.216 66，說明反應的Ct值與質粒濃度的拷貝數log值成反比，實時熒光定量PCR標準曲線的R2=0.980 82，說明不同拷貝數與其對應的Ct值具有很高的相關性，準確性好，能用于后續進一步的熒光定量分析。

2.4 內生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進行實時熒光定量PCR，熒光擴增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應的Ct值代入標準曲線方程中，計算芽胞桿菌DNA拷貝數的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數量。

2.5 檢測結果

由表1可知，利用Ct值代入標準曲線方程中計算出的拷貝數范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標準曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數量均明顯大于空白處理。

3 結論

本試驗通過實時熒光定量PCR檢測了魔芋內生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數據不能說明該內生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關系，因此，需要后面繼續進行研究，檢測該內生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關系。另外，該定量方法并不能說明所檢測的內生菌數量全部是芽孢桿菌BS-8，因為魔芋葉片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說熒光定量PCR檢測的定殖芽孢桿菌含量并不準確，因為熒光定量PCR并不能進行物種分類，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會被檢測到，單純的16S rRNA引物并不能用來對特異的某種微生物進行準確定量分析，尤其在比較復雜的微生物體中，如果要進行更精確的分析，應采用探針法進行研究。

參考文獻：

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