狗牙根黑穗病病原菌的鑒定及其培養特性

羅海瀾+王飛+馬旭園+李新偉+劉少娟

摘要：狗牙根（Cynodon dactylon）是耕地、果園及其他草種草坪常見的惡性雜草，為探索其生物防治方法，試驗從患黑穗病狗牙根穗部分離到一株真菌LHL1，對其進行分子鑒定及生物學特性研究。液體發酵培養確定其最佳碳源和氮源及最適pH；苯胺藍染色、光學顯微鏡鏡檢法觀察感病狗牙根各部位菌絲和孢子分布情況。結果表明，菌株LHL1為擔子菌亞門（Basidiomycotina）黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌屬（Ustilago）；該菌的最佳碳源和氮源分別為甘油和水解乳蛋白，最佳pH為5；鏡檢結果顯示在感病植株的葉鞘內表皮有大量菌絲及孢子分布，莖、葉及分蘗芽鞘表面均有孢子存在。

關鍵詞：狗牙根（Cynodon dactylon）； 菌株LHL1；生物防治

中圖分類號：S543+.9；S435.121.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0575-05

狗牙根（Cynodon dactylon）又名百慕達，為禾本科多年生草本植物，匍匐莖發達，蔓延力強[1，2]，根狀莖具有解熱利尿、舒筋活血的作用，葉提取物具降低血糖、抗氧化的作用[3]。狗牙根目前作為草坪草種廣受歡迎，但因其侵占性和再生性強，是耕地、果園及其他草坪草種的危害性雜草。

黑穗病是一種由幼苗期進行系統性侵染從而引發全株發病的病害，苗期侵染花期發病，花期穗上具充滿孢子堆的病癭[4]，感病花不能正常開花結子。狗牙根黑穗病的高發期在每年的7～9月，主要依靠孢子傳播。狗牙根黑穗病致病菌通過來自種皮或土壤的越冬孢子產生菌絲侵染發芽種子的胚芽鞘，并擴散至整個植物組織；狗牙根黑穗病致病菌對狗牙根的種子萌發、出苗無影響，但對匍匐枝的生長、干物質總量的積累、競爭力都有明顯的降低作用[5]。在中國有關狗牙根黑穗病致病菌的研究鮮有報道；在其他國家，早在20世紀70年代對狗牙根黑穗病致病菌有相關報道，但主要集中在不同碳源及抗生素對菌落形態的影響，以及氯霉素對狗牙根黑穗病致病菌呼吸鏈電子傳遞的影響等[6，7]。

狗牙根黑穗病致病菌可嚴重影響狗牙根草坪生長成坪，但對防除田園狗牙根雜草具有積極作用。本研究從漯河醫學高等專科學校草坪患黑穗病狗牙根花穗上分離到一株真菌，對其進行了微生物學及分子生物學鑒定，以期為將狗牙根黑穗病致病菌開發成狗牙根生防菌提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 菌株LHL1由實驗室人員從漯河醫學高等專科學校草坪感病狗牙根穗分離得到。

1.1.2 培養基、試劑和儀器 營養瓊脂斜面培養基，馬鈴薯蔗糖固體培養基（每升成分：馬鈴薯20 g， 蔗糖20 g，瓊脂18 g），馬鈴薯蔗糖液體培養基（每升成分：馬鈴薯20 g， 蔗糖20 g），基礎培養基（用200 g馬鈴薯煮水后濾液定容至1 000 mL），1%酵母膏培養基；試劑均為分析純；Pfu高保真酶、底物以及總DNA提取試劑盒均采用北京全式金生物技術公司產品。OLYMPUS Bx51型光學顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]。LGJ-18S型冷凍干燥機（北京松源華興科技發展有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離純化及保存

菌株分離：在超凈臺上將感病植株穗部輕輕接觸馬鈴薯蔗糖固體培養基，使孢子脫落至培養基，28 ℃光照培養至長出菌落，再挑單菌落接種于另一個馬鈴薯蔗糖固體培養基，進行菌株分離純化。獲得菌株LHL1于營養瓊脂斜面培養基4 ℃保存。

1.2.2 培養方法

活化培養：將保存于4 ℃營養瓊脂斜面培養基的菌株 LHL1接種于直徑9 cm的馬鈴薯蔗糖固體培養基上，28 ℃培養。

種子液培養：無菌條件下，用接種針從培養好的平皿中挑取單菌落接種于裝有100 mL 馬鈴薯蔗糖液體培養基的 250 mL三角瓶中，在28 ℃，200 r/min振蕩培養3 d。

搖瓶發酵培養：無菌條件下，按0.6%接種量吸取種子液轉接于含100 mL馬鈴薯蔗糖液體培養基的250 mL三角瓶中，在28 ℃，200 r/min振蕩培養。

1.2.3 不同培養基對LHL1菌落形態的影響 將菌株LHL1分別接種到8個1%酵母膏培養基上，并在其中7個培養基中分別添加3%蔗糖、4%葡萄糖、0.5%葡萄糖、3%果糖、3%麥芽糖、3%甘油、3%乳酸鈣，28 ℃培養5 d觀察菌落形態。

1.2.4 處理設置 在基礎培養基中分別添加濃度為20 g/L的不同碳源：甘露糖、葡萄糖、果糖、甘油、麥芽糖、乳酸鈣、蔗糖，28 ℃、200 r/min搖床培養7 d，以確定最佳碳源；20 g/L甘油+基礎培養基中分別添加濃度為2 g/L的不同氮源：氯化銨、硝酸鉀、尿素、甘氨酸、水解乳蛋白、酵母膏，以20 g/L甘油+基礎培養基為對照（CK）；在馬鈴薯蔗糖液體培養基中用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH調pH至4、5、6、7、8、9、10。所有處理設3個重復。

1.2.5 LHL1菌株ITS鑒定 ITS鑒定采用試劑盒提取并純化LHL1菌株總DNA，對ITS保守序列進行PCR擴增獲得目的基因片段。通用引物分別為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR反應體系如下：10×Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，引物各1 μL，Taq酶l μL （5 U/μL），模板DNA 1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，54 °C退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 °C延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗后送上海生工生物技術公司進行測序。

1.2.6 寄主體內菌絲及孢子分布檢測 選取感病狗牙根的葉鞘內表皮、葉表、莖表、莖髓、根表、分蘗幼芽鞘內表皮進行菌絲及孢子鏡檢。用苯胺藍溶液（0.5 g苯胺藍，99 mL 蒸餾水，1 mL冰乙酸）染色10 min后光學顯微鏡下檢測[8]。其中葉片染色前用無水乙醇進行脫色處理。

1.2.7 數據處理 檢驗正態分布和1-way ANOVA 檢驗處理間均值差異，顯著性由統計軟件Statistical Analysis System Version 8完成，用Microsoft Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌株LHL1菌落形態的影響

根據“1.2.3”觀察不同培養基對菌株LHL1菌落形態的影響結果見圖1。由圖1可見，顯微鏡下3種菌落的菌形狀并無顯著差異，多數為分裂生長的梭狀菌體，少量菌絲。1%酵母膏培養基的菌落為覆膜狀，淺褐色、邊緣不規則（圖1B）；1%酵母膏+3%甘油培養基的菌落為褐色褶皺的白毛絨狀（圖1C）；1%酵母膏+4%葡萄糖培養基的菌落為雪花狀，白色、邊緣毛絨狀（圖1A），其他培養基的菌落形態與圖1A類同。

2.2 不同碳源對菌株LHL1生長量及菌形態的影響

不同碳源對菌株LHL1生長量的影響見圖2。由圖2可知，菌株LHL1在以甘油為碳源時生長量最大，其次為蔗糖、麥芽糖、甘露糖、葡萄糖、果糖，以乳酸鈣為碳源時生長量最低。不同碳源對菌株LHL1形態的影響見圖3。由圖3可知，以乳酸鈣為碳源時菌株LHL1多為絲狀（圖3A），由老菌絲萌發形成新的菌絲；以蔗糖為碳源時菌株LHL1多為長橢圓形，呈現出芽殖或假絲狀（圖3B），其他碳源的菌形態與圖3B類同。這說明該菌在利用率較高的碳源上生長快，分裂旺盛；在利用率較低的碳源上生長慢，分裂少，多為絲狀延伸生長。

2.3 不同氮源對菌株LHL1生長量及菌形態的影響

以甘油為碳源，添加不同氮源后對菌株LHL1生長量的影響見圖4。由圖4可知，與對照相比，20 g/L甘油+基礎培養基中加入氮源除尿素外均能促進菌株LHL1的生長，其中又以水解乳蛋白促生長效果顯著，其他依次為酵母膏、氯化銨、甘氨酸、硝酸鉀。值得注意的是培養基中添加尿素后檢測不到菌株LHL1的生長量，這可能與尿素導致培養基呈堿性有關。光學顯微鏡下觀察菌的形態，不同氮源對菌的形態沒有影響，菌體多為酵母狀裂殖生長；中間膨大呈橢圓形兩端細小，或一端膨大一端細小（圖5）。

2.4 不同初始pH對菌株LHL1生長量及菌形態的影響

不同初始pH的馬鈴薯蔗糖液體培養基對菌株LHL1生長量的影響見圖6。由圖6可知，菌株LHL1在偏酸性環境中生長較好，當初始pH為4～7時生長量較高，初始pH為5時生長量最高；當初始pH偏堿性時，菌株LHL1生長量逐漸減少，初始pH為10時菌株LHL1生長量極低。這一結果與茭白狗牙根黑穗病致病菌生長適宜pH為5～6結果相符[9]。鏡檢發現（圖7）pH 4～6時菌株LHL1多為橢圓形，少數一端生長菌絲；pH 7～9時，菌株LHL1多數兩端生長菌絲。推測菌株LHL1適宜在弱酸性環境下生長，以分裂或出芽形式繁殖；在堿性條件下不利于其生長，分裂繁殖困難，菌體進行營養生長，兩端生長出菌絲。

2.5 ITS片段的序列測定和進化樹分析

本實驗室于2009年分離到菌株LHL1，經柯霍氏法則確定該菌為狗牙根黑穗病致病菌，并對其進行分子生物學鑒定。用引物對菌株LHL1的 DNA做PCR擴增其ITS序列，擴增結果送上海生工測序。序列提交GenBank，獲登錄序列號JX477170。與NCBI上相似序列經BLAST比對的結果表明：該菌株與Ustilago屬的Ustilago cynodontis UE的ITS序列相似度為95%，與 Ustilago tritici PDSUT2的ITS序列相似度為94%，與Basidiomycete sp. nasa47的ITS序列相似度為91%。根據比對結果，在GenBank中選取與ITS序列相似度高的菌株LHL1及狗牙根寄生菌構建系統發育樹，結果顯示，LHL1與Ustilago cynodontis UE構成一枝。進化分析結合形態分析確定菌株LHL1屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌屬（Ustilago）。

利用序列比對軟件ClustalX 1.83和系統發育分析軟件PHYLIP3.68使用Neigh-bor-Joining法構建系統進化樹， TreeView軟件示圖如圖8。

2.6 寄主體內LHL1菌絲及孢子分布

用苯胺藍染色后對感病狗牙根的葉鞘內表皮、葉片表皮、莖表皮、莖髓、根表皮、胚芽鞘表皮分蘗進行鏡檢，結果見表1。由表1可知，感病植株葉鞘內表皮氣孔處有大量菌絲及孢子分布（圖9A），在葉鞘表面傷痕處菌絲和孢子集中分布（圖9B）。這可能是表皮的破損有利于菌絲由內生長并產孢，也可能是外面的孢子更容易在破損處萌發存活；葉片表皮、葉鞘內表皮、莖表皮及胚芽鞘表皮分蘗有少量孢子和菌絲分布；莖髓有菌絲檢出。這一結果表明該菌不僅在寄主穗部大量產孢，在寄主的葉鞘、葉、莖及胚芽鞘的表面都會產孢。在組織結構比較幼嫩的葉鞘內表皮和穗部大量產孢，其原因可能是組織結構幼嫩有利于菌絲突破葉表皮結構，穗部作為生殖器官營養物質更為豐富，穗部表面積大，有利于菌絲生長、產孢。

3 小結與討論

本研究于2009年分離到菌株LHL1，經柯霍氏法則確定該菌為狗牙根黑穗病致病菌。結果顯示，菌株LHL1在1%酵母膏中添加0.5%葡萄糖以及乳酸鈣為碳源時，LHL1菌落形態呈雪花狀，與前人報道的菌落形態為覆膜狀不同[6]。此外，發現這兩種培養基上的LHL1菌斑塊不能傳代生長，但將單菌落打散后用無菌水制成菌液再涂平板或劃線培養即能生長，是否存在菌自身生長限制因素，需要另做探究。菌株LHL1最佳碳源和氮源分別為甘油和水解乳蛋白，這與玉米瘤黑粉菌、水稻黑粉菌生長的最佳碳、氮源不同[10，11]。試驗中添加尿素菌株不能生長，pH為5時生長量最高，pH為10時菌體生長量最低，這也印證解釋了添加尿素為氮源時菌株LHL1不能生長的現象。當環境條件適宜其生長時，菌呈長橢圓形，以酵母方式分裂生殖，生長旺盛；環境不適宜時菌多呈菌絲態，分裂生殖少，生長量較低。Durieu等[6]也描述了狗牙根黑穗病致病菌存在菌絲和類酵母兩種形態，低糖、非發酵型糖、抗生素以及溴化乙錠可以誘導形成類酵母形態菌。本研究發現在不同碳源下，該菌落形態與Durieu等[6]報道的存在差異，可能由于不同時間和地理位置存在變種導致的。

早在上世紀70年代，國外有對狗牙根黑穗病致病菌的研究，由于當時的試驗條件受限都未進行分子鑒定[6，7]，本研究中經ITS序列分析，確定狗牙根黑穗病致病菌屬黑粉菌屬。黑粉菌屬類菌在人工培養基上難完成生活史并產生冬孢子，該菌屬以冬孢子萌發產生雙核菌絲入侵寄主幼苗生長錐，完成侵染過程。本研究中涉及到的多種固體和液體培基，菌株LHL1產生大量次生擔孢子，未見冬孢子形式。后期研究其菌絲及幾種孢子侵染寄主的能力，探究其開發生防菌潛力。

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早在上世紀70年代，國外有對狗牙根黑穗病致病菌的研究，由于當時的試驗條件受限都未進行分子鑒定[6，7]，本研究中經ITS序列分析，確定狗牙根黑穗病致病菌屬黑粉菌屬。黑粉菌屬類菌在人工培養基上難完成生活史并產生冬孢子，該菌屬以冬孢子萌發產生雙核菌絲入侵寄主幼苗生長錐，完成侵染過程。本研究中涉及到的多種固體和液體培基，菌株LHL1產生大量次生擔孢子，未見冬孢子形式。后期研究其菌絲及幾種孢子侵染寄主的能力，探究其開發生防菌潛力。

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