喜樹(shù)內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹(shù)堿菌株的篩選及藥化研究

曹晉靜+康冀川

摘要：采用PDA培養(yǎng)基對(duì)151株喜樹(shù)內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵，未篩選出產(chǎn)喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌，而采用喜樹(shù)種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，即在PDA培養(yǎng)基中加入了喜樹(shù)種子的煎汁，結(jié)果從151株內(nèi)生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)喜樹(shù)堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹(shù)堿的1株。試驗(yàn)篩選出了能產(chǎn)喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌。

關(guān)鍵詞：喜樹(shù)；喜樹(shù)堿；內(nèi)生真菌

中圖分類號(hào)：S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）03-0565-04

喜樹(shù) （Camptothecaa cuminata Decne.）又名旱蓮木、千仗樹(shù)，屬珙桐科（藍(lán)果樹(shù)科、紫樹(shù)科）（Nyssaceae）喜樹(shù)屬（Camptotheca Decne.），多年生亞熱帶落葉闊葉樹(shù)，是我國(guó)特有的樹(shù)種，在我國(guó)的分布較為廣闊，南至云南的西雙版納，北至山西秦嶺地區(qū)[1]。喜樹(shù)中含有多種有活性的化合物，如喜樹(shù)堿、喜樹(shù)次堿，10-羥基喜樹(shù)堿等。研究表明，喜樹(shù)堿及其衍生物具有顯著的抗腫瘤活性，現(xiàn)已用于直腸癌及卵巢癌的臨床治療[2]。從植物內(nèi)生真菌與寄主植物同步演化關(guān)系推測(cè)，喜樹(shù)內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物中可能含有喜樹(shù)堿及其衍生物[3]。目前對(duì)于喜樹(shù)的研究主要集中在喜樹(shù)堿及其衍生物的提取、純化、檢測(cè)等工藝上，而對(duì)其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道較少。以內(nèi)生真菌與植物的特殊關(guān)系為切入點(diǎn)研究喜樹(shù)內(nèi)生真菌與喜樹(shù)堿及其衍生物的相關(guān)性，可以為喜樹(shù)堿及其衍生物的開(kāi)發(fā)以及為尋找新型抗癌藥物開(kāi)辟一條新的道路。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)基

從喜樹(shù)根、莖、葉、果實(shí)中分離得到151株內(nèi)生真菌。

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：沸煮后的馬鈴薯汁加葡萄糖20 g，不加瓊脂，滅菌。喜樹(shù)種子煎汁培養(yǎng)基：稱取50 g喜樹(shù)種子粉碎后煮沸30 min，添加到100 mL PDA培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱取喜樹(shù)堿及10-羥基喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品0.002 5 g，置于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析純）溶解，超聲波助溶，最后定容，濃度分別為0.1、0.05 mg/mL。

1.2.2 菌株的發(fā)酵及樣品溶液的制備 采用兩種培養(yǎng)基對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，一是PDA培養(yǎng)基，二是喜樹(shù)種子煎汁培養(yǎng)基。滅菌后接入一定量的菌絲體， 28 ℃、120 r/min 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，7 d后將發(fā)酵液用2層紗布過(guò)濾得到菌絲球，40 ℃干燥，粉碎。

菌絲體處理方法：稱取1.5～2.0 g粉碎后的菌絲，加入甲醇（分析純）5 mL，超聲波破碎30 min，靜置24 h，取其上清液并用甲醇補(bǔ)足損失的重量，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次，0.45 μm纖維慮膜過(guò)濾。發(fā)酵液處理方法：將發(fā)酵液裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入5 mL甲醇（色譜純）溶解，超聲波30 min助溶，靜置24 h后用0.45 μm油性纖維濾膜過(guò)濾2～3次。

1.2.3 HPLC色譜條件 C18柱（直徑15 cm×4 mm ID），檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速0.8 mL/min，柱溫55 ℃，流動(dòng)相甲醇、水體積比為4∶6，進(jìn)樣體積10 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)液的濃度分別稀釋成0.004、0.005、0.006、0.007、0.008 mg/mL。10-羥基喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)液的濃度稀釋成：0.002 5、0.003 0、0.003 5、0.004 0、0.004 5 mg/mL。按照“1.2.3”的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)3次，取峰面積平均值，得出峰面積（y）與濃度（x）的線性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿菌株的初篩結(jié)果

分別對(duì)內(nèi)生真菌的發(fā)酵液和菌絲體提取液進(jìn)行處理，采用TLC法初步篩選發(fā)現(xiàn)，用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)生真菌發(fā)酵液和菌絲體不含喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿；用喜樹(shù)種子煎汁培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，其發(fā)酵液不含喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿，但在菌絲體提取液中發(fā)現(xiàn)有3株內(nèi)生真菌的檢測(cè)斑點(diǎn)與喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)（標(biāo)準(zhǔn)品Rf=0.80，樣品Rf值分別是0.79、0.82、0.82），這3株菌分別是QZ04、CY02和XY09，見(jiàn)圖1；并且還發(fā)現(xiàn)有1株編號(hào)為XY05的內(nèi)生真菌的檢測(cè)斑點(diǎn)與10-羥基喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)（標(biāo)準(zhǔn)品Rf=0.60，樣品Rf=0.62），見(jiàn)圖2。初步判斷為是產(chǎn)活性產(chǎn)物的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定，還需用HPLC法再進(jìn)行定性定量的檢測(cè)。

2.2 產(chǎn)喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿菌株的定性分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜見(jiàn)圖3。喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為12.732 min，峰面積為965.212 mAU；10-羥基喜樹(shù)堿標(biāo)品保留時(shí)間為7.293 min，峰面積為1 805.47 mAU。

2.2.2 樣品的HPLC圖 產(chǎn)喜樹(shù)堿菌株提取物的HPLC圖譜見(jiàn)圖4。產(chǎn)10-羥基喜樹(shù)堿菌株提取物的HPLC圖譜見(jiàn)圖5。

比較標(biāo)準(zhǔn)品與4個(gè)樣品的HPLC檢測(cè)峰圖，發(fā)現(xiàn)4個(gè)樣品均有與標(biāo)準(zhǔn)品相似的保留時(shí)間（表1、表2）。綜合試驗(yàn)結(jié)果可以判斷樣品中確實(shí)含有喜樹(shù)堿及其類似物。

2.2.3 菌株中喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿的含量測(cè)定 通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以較準(zhǔn)確地計(jì)算出內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿的含量。喜樹(shù)堿和10-羥基喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見(jiàn)圖6、圖7。

建立回歸方程，喜樹(shù)堿：y=19 058x-0.4913（r=0.999 8）；10-羥基喜樹(shù)堿：y=35 357x+0.144 1（r=0.999 7）。將所測(cè)樣品的峰面積代入回歸方程計(jì)算濃度，再換算出QZ04內(nèi)生真菌喜樹(shù)堿產(chǎn)量為0.029 mg/g，CY02為0.024 mg/g，XY09為0.037 mg/g；XY05 10-羥基喜樹(shù)堿的產(chǎn)量為0.017 mg/g。

3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)采用TLC法和HPLC法從151株內(nèi)生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)喜樹(shù)堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹(shù)堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點(diǎn)霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤(pán)孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內(nèi)生真菌與宿主植物在長(zhǎng)期的適應(yīng)進(jìn)化過(guò)程中，也可能會(huì)使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗(yàn)采用了喜樹(shù)種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并作了對(duì)照試驗(yàn)，即使用不加誘導(dǎo)物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加誘導(dǎo)物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹(shù)堿及其類似物。此外，為進(jìn)一步確定喜樹(shù)堿是由內(nèi)生真菌產(chǎn)生而不是來(lái)自于種子煎汁，本試驗(yàn)還同時(shí)檢測(cè)了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿，結(jié)果未檢測(cè)出。表明了這4株喜樹(shù)內(nèi)生真菌確實(shí)是在喜樹(shù)種子產(chǎn)生的某種前體物質(zhì)刺激下產(chǎn)生了喜樹(shù)堿及其類似物。

3）喜樹(shù)植株的器官均能產(chǎn)生喜樹(shù)堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹(shù)堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿的內(nèi)生真菌有3株來(lái)自喜樹(shù)葉，1株來(lái)自喜樹(shù)種子。可能因?yàn)槿~子和種子內(nèi)喜樹(shù)堿的高含量，才使得該部位的內(nèi)生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因?yàn)槭艿较矘?shù)葉子和種子自身內(nèi)生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹(shù)堿含量高于其他部位。具體情況有待進(jìn)一步的研究。

4）試驗(yàn)加入了50 g喜樹(shù)種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，較劉蘊(yùn)哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質(zhì)的產(chǎn)量卻沒(méi)有成線性增長(zhǎng)，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊(yùn)哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點(diǎn)：第一，不同種類的內(nèi)生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進(jìn)一步的篩選；第二，所加入的誘導(dǎo)物太多或太少都不利于內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報(bào)道指出，喜樹(shù)堿在某種程度上也會(huì)阻礙自身內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)[8]。誘導(dǎo)物最適量還有待進(jìn)一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹(shù)堿的含量很低，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場(chǎng)滿足人們的需求還必須通過(guò)一系列的手段和途徑來(lái)提高內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹(shù)堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導(dǎo)物外，還可尋找一些真菌代謝調(diào)節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用是提高內(nèi)生真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的一個(gè)有效途徑，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行遺傳改造，通過(guò)原生質(zhì)體誘變，遺傳轉(zhuǎn)化，以及基因調(diào)控等分子手段也有望解決內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問(wèn)題。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 星.喜樹(shù)的分布現(xiàn)狀、藥用價(jià)值及發(fā)展前景[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004（S2）：169-173.

[2] 李立源，張冬艷，白鳳武. 喜樹(shù)堿及其衍生物的研究進(jìn)展[J].大連民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，3（4）：17-22.

[3] 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

[4] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[5] 巴尼特，沈崇堯.半知菌屬圖解[M].第三版.北京：科學(xué)出版社，1977.

[6] 李承森.植物科學(xué)進(jìn)展[M].第二版.北京：高等教育出版社，1999，183-190.

[7] 劉蘊(yùn)哲.喜樹(shù)生態(tài)系內(nèi)生真菌的分子鑒定及藥物化學(xué)研究[D].貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2006.

[8] 劉文哲，張愛(ài)新，REINSCHEID U M.喜樹(shù)內(nèi)生菌與喜樹(shù)堿的關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（7）：1275-1278.

3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)采用TLC法和HPLC法從151株內(nèi)生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)喜樹(shù)堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹(shù)堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點(diǎn)霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤(pán)孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內(nèi)生真菌與宿主植物在長(zhǎng)期的適應(yīng)進(jìn)化過(guò)程中，也可能會(huì)使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗(yàn)采用了喜樹(shù)種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并作了對(duì)照試驗(yàn)，即使用不加誘導(dǎo)物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加誘導(dǎo)物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹(shù)堿及其類似物。此外，為進(jìn)一步確定喜樹(shù)堿是由內(nèi)生真菌產(chǎn)生而不是來(lái)自于種子煎汁，本試驗(yàn)還同時(shí)檢測(cè)了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿，結(jié)果未檢測(cè)出。表明了這4株喜樹(shù)內(nèi)生真菌確實(shí)是在喜樹(shù)種子產(chǎn)生的某種前體物質(zhì)刺激下產(chǎn)生了喜樹(shù)堿及其類似物。

3）喜樹(shù)植株的器官均能產(chǎn)生喜樹(shù)堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹(shù)堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿的內(nèi)生真菌有3株來(lái)自喜樹(shù)葉，1株來(lái)自喜樹(shù)種子。可能因?yàn)槿~子和種子內(nèi)喜樹(shù)堿的高含量，才使得該部位的內(nèi)生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因?yàn)槭艿较矘?shù)葉子和種子自身內(nèi)生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹(shù)堿含量高于其他部位。具體情況有待進(jìn)一步的研究。

4）試驗(yàn)加入了50 g喜樹(shù)種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，較劉蘊(yùn)哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質(zhì)的產(chǎn)量卻沒(méi)有成線性增長(zhǎng)，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊(yùn)哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點(diǎn)：第一，不同種類的內(nèi)生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進(jìn)一步的篩選；第二，所加入的誘導(dǎo)物太多或太少都不利于內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報(bào)道指出，喜樹(shù)堿在某種程度上也會(huì)阻礙自身內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)[8]。誘導(dǎo)物最適量還有待進(jìn)一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹(shù)堿的含量很低，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場(chǎng)滿足人們的需求還必須通過(guò)一系列的手段和途徑來(lái)提高內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹(shù)堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導(dǎo)物外，還可尋找一些真菌代謝調(diào)節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用是提高內(nèi)生真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的一個(gè)有效途徑，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行遺傳改造，通過(guò)原生質(zhì)體誘變，遺傳轉(zhuǎn)化，以及基因調(diào)控等分子手段也有望解決內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問(wèn)題。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 星.喜樹(shù)的分布現(xiàn)狀、藥用價(jià)值及發(fā)展前景[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004（S2）：169-173.

[2] 李立源，張冬艷，白鳳武. 喜樹(shù)堿及其衍生物的研究進(jìn)展[J].大連民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，3（4）：17-22.

[3] 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

[4] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[5] 巴尼特，沈崇堯.半知菌屬圖解[M].第三版.北京：科學(xué)出版社，1977.

[6] 李承森.植物科學(xué)進(jìn)展[M].第二版.北京：高等教育出版社，1999，183-190.

[7] 劉蘊(yùn)哲.喜樹(shù)生態(tài)系內(nèi)生真菌的分子鑒定及藥物化學(xué)研究[D].貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2006.

[8] 劉文哲，張愛(ài)新，REINSCHEID U M.喜樹(shù)內(nèi)生菌與喜樹(shù)堿的關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（7）：1275-1278.

3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)采用TLC法和HPLC法從151株內(nèi)生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)喜樹(shù)堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹(shù)堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點(diǎn)霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤(pán)孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內(nèi)生真菌與宿主植物在長(zhǎng)期的適應(yīng)進(jìn)化過(guò)程中，也可能會(huì)使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗(yàn)采用了喜樹(shù)種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并作了對(duì)照試驗(yàn)，即使用不加誘導(dǎo)物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加誘導(dǎo)物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹(shù)堿及其類似物。此外，為進(jìn)一步確定喜樹(shù)堿是由內(nèi)生真菌產(chǎn)生而不是來(lái)自于種子煎汁，本試驗(yàn)還同時(shí)檢測(cè)了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿，結(jié)果未檢測(cè)出。表明了這4株喜樹(shù)內(nèi)生真菌確實(shí)是在喜樹(shù)種子產(chǎn)生的某種前體物質(zhì)刺激下產(chǎn)生了喜樹(shù)堿及其類似物。

3）喜樹(shù)植株的器官均能產(chǎn)生喜樹(shù)堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹(shù)堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹(shù)堿或10-羥基喜樹(shù)堿的內(nèi)生真菌有3株來(lái)自喜樹(shù)葉，1株來(lái)自喜樹(shù)種子。可能因?yàn)槿~子和種子內(nèi)喜樹(shù)堿的高含量，才使得該部位的內(nèi)生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因?yàn)槭艿较矘?shù)葉子和種子自身內(nèi)生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹(shù)堿含量高于其他部位。具體情況有待進(jìn)一步的研究。

4）試驗(yàn)加入了50 g喜樹(shù)種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，較劉蘊(yùn)哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質(zhì)的產(chǎn)量卻沒(méi)有成線性增長(zhǎng)，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊(yùn)哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點(diǎn)：第一，不同種類的內(nèi)生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進(jìn)一步的篩選；第二，所加入的誘導(dǎo)物太多或太少都不利于內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報(bào)道指出，喜樹(shù)堿在某種程度上也會(huì)阻礙自身內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)[8]。誘導(dǎo)物最適量還有待進(jìn)一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹(shù)堿及其類似物的內(nèi)生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹(shù)堿的含量很低，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場(chǎng)滿足人們的需求還必須通過(guò)一系列的手段和途徑來(lái)提高內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹(shù)堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導(dǎo)物外，還可尋找一些真菌代謝調(diào)節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用是提高內(nèi)生真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的一個(gè)有效途徑，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行遺傳改造，通過(guò)原生質(zhì)體誘變，遺傳轉(zhuǎn)化，以及基因調(diào)控等分子手段也有望解決內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問(wèn)題。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 星.喜樹(shù)的分布現(xiàn)狀、藥用價(jià)值及發(fā)展前景[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004（S2）：169-173.

[2] 李立源，張冬艷，白鳳武. 喜樹(shù)堿及其衍生物的研究進(jìn)展[J].大連民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，3（4）：17-22.

[3] 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

[4] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[5] 巴尼特，沈崇堯.半知菌屬圖解[M].第三版.北京：科學(xué)出版社，1977.

[6] 李承森.植物科學(xué)進(jìn)展[M].第二版.北京：高等教育出版社，1999，183-190.

[7] 劉蘊(yùn)哲.喜樹(shù)生態(tài)系內(nèi)生真菌的分子鑒定及藥物化學(xué)研究[D].貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2006.

[8] 劉文哲，張愛(ài)新，REINSCHEID U M.喜樹(shù)內(nèi)生菌與喜樹(shù)堿的關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（7）：1275-1278.