微透析和高效液相色譜法測定大鼠腦內天麻素及天麻苷元含量

呂允鳳

·藥學研究·

微透析和高效液相色譜法測定大鼠腦內天麻素及天麻苷元含量

呂允鳳

目的 考察不同劑量天麻素皮下及口服給藥后大鼠腦內的天麻素及其代謝產物天麻苷元的濃度變化。方法 采用腦內微透析技術進行在體動態取樣，建立了高效液相-串聯四級桿質譜方法測定腦透析液中的天麻素含量，建立了高效液相-二極管陣列檢測方法測定腦透析液中的天麻苷元含量。結果 兩種給藥方式大鼠不同腦區內天麻素濃度均較低，天麻苷元腦內濃度明顯高于其原型藥物天麻素。結論 天麻素的血腦屏障透過能力差，但其活性代謝產物天麻苷元能夠較好地進入腦內發揮作用。

天麻素；天麻苷元；高效液相-串聯四級桿質譜；高效液相-二極管陣列檢測；微透析

0 引言

天麻素(Gastrodin，GAS)是我國傳統中藥天麻的主要有效成分，近年來被用于改善學習記憶功能和治療老年癡呆[1-2]。其代謝產物天麻苷元(Gastrodigenin，p-hydroxybenzyl alcohol，HBA)同樣具備對神經的保護作用等活性[3]。腦是GAS的作用靶器官，有觀點認為，其腦內作用是通過HBA實現的，而目前對GAS腦內主要存在形式及入腦情況的研究較少。本文采用微透析技術對給藥后大鼠進行連續取樣，測定皮下及口服給藥后大鼠腦內不同腦區GAS和HBA濃度，對GAS及其代謝產物的入腦情況進行研究。

1 儀器與試藥

大鼠腦定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、牙科直型手機(日本NSK公司)、THOMAS ISO 014牙科鉆頭(法國 BORGES公司)、B030802與B030503型微透析探針(綿陽高新區佰脈生物儀器有限公司)、Ⅱ型自凝造牙粉(上海珊瑚化工廠)、PHD2000型微量恒流泵及微量控制器(美國HARVARD公司)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽(美國SIGMA公司)。

Waters2795型高效液相色譜儀(美國Waters公司)、Quattro premier串聯質譜儀(美國Waters公司)、Waters996型二極管陣列檢測器(美國Waters公司)、symmetryShieldTMRP18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm美國Waters公司)、Waters MassLynxTM 4.0工作站(美國Waters公司)。

麻醉用戊巴比妥鈉(純度99%，國藥集團化學試劑有限公司，WS20070403)、GAS對照品(純度99.8%，中國藥品生物制品檢定所，110807-200205)、HBA對照品(純度99.4%，中國藥品生物制品檢定所，110896-200001)、甲酸(美國SIGMA公司)、甲酸胺(美國SIGMA公司)、甲醇(HPLC級，美國TEDIA公司)、乙腈(ABSOLVE級，美國TEDIA公司)。

實驗動物：雄性Sprague-Dawley大鼠(北京實驗動物中心維通利華公司提供)，250～300 g。實驗動物生產許可證號：SYXK(京)2003-0008。

2 方法與結果

2.1 大鼠腦內微透析方法[4-6]Dulbecco′s灌流液的配制：取Dulbecco′s磷酸緩沖鹽加水及CaCl2溶液配制成含138 mmol/L NaCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，2.7 mmol/L KCl，1.5 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L MgCl2和1.2 mmol/L CaCl2，pH值7.4的緩沖溶液。

藥物配制及給藥分組：SD大鼠共48只，分為皮下給藥組和灌胃給藥組。皮下給藥組分為3個劑量組，每組12只，分別為10 mg/kg組、30 mg/kg組、50 mg/kg組；灌胃組12只，為50 mg/kg劑量組。每只大鼠均進行中層額前皮質(mPFC)、伏核(NAC)和海馬(HIP)腦區的手術。

大鼠手術操作：將大鼠麻醉后，分別在腦內mPFC、NAC及HIP腦區植入探針導管。以1.5 μL/min灌流速度進行取樣，在收集1個空白樣品(每次30 min)透析穩定后，以此點為零時間點，經皮下給藥管或灌胃給予一定劑量的藥物，于第30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 min換收集管收集透析液。

2.2 腦透析液中GAS分析方法的建立[7]GAS儲備液及標準液的配制：準確配制質量濃度為5 mg/mL的GAS對照品儲備液。然后采用甲醇作為稀釋液，將儲備液稀釋后，制成濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、50、100、500、1 000 μg/mL的GAS標準工作液。以唑吡坦配制250 ng/mL內標溶液備用。

2.2.1 色譜條件 美國Waters公司symmetryShieldTMRP18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。選用含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的水(A)-含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的甲醇(B)系統作為流動相。采用梯度洗脫。起始比例為A∶B=97.5∶2.5，0 min開始，B相以變化曲線2的速率從2.5%上升到90%(0～2 min)，維持該比例8 min(2～10 min)，10 min起B相比例在1 min內回復到起始的2.5%，最后A∶B=97.5∶2.5水平維持4 min，整個分析時間為15 min，梯度流速恒定為0.2 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量20 μL。內標和GAS對照品的保留時間分別為4.72 min和4.37 min。

2.2.2 質譜條件 ESI+離子源；掃描范圍m/z 100～1 000；毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓25 V；離子源溫度105 ℃；脫溶劑氣(N2)溫度350 ℃；流速60 μL/min；碰撞氣(Ar)流速0.25 mL/min；碰撞誘導電壓(CID)分別為15 V(GTD)、20 V(LZH)和20 V(IS)。MRM檢測：m/z 303.9→m/z 106.7(GTD)、m/z 136.8→m/z 54.9(LZH)和m/z 308.2→m/z 235.0(IS)。

2.2.3 方法的專屬性考察 將內標色譜圖(圖1A)、GAS色譜圖(圖1B)及空白腦透析液色譜圖(圖1C)進行比較。由圖可見，基線噪音較小，藥物及內標峰形良好，無雜質峰干擾。說明本方法具有較高的專屬性。

圖1 色譜圖

2.2.4 線性關系考察 配制濃度為0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10、50、100、500、1 000 ng/mL的標準溶液。以樣品與內標的峰面積之比(R)和樣品的濃度(C)做線性回歸得到標準曲線，權重系數為1/X，線性范圍為0.05～1 000 ng/mL，回歸方程為Y=0.050 6X+0.169 8，r=0.999 8。檢測限和定量限分別以信噪比S/n=3∶1和S/n=10∶1計。在腦透析液中，定量下限低于0.05 ng/mL，最低檢測限和定量限分別約為0.028 ng/mL和0.040 ng/mL。

2.2.5 回收率與精密度 配制3個濃度分別為500.0、10.00、0.100 0 ng/mL的質控樣品(QC)溶液各5份，考察日內精密度、日間精密度并計算相對回收率。各質控日內日間精密度RSD均小于4%，相對回收率(%)分別為(99.7±2.1)、(101.4±2.7)和(101.2±1.6)。

穩定性考察：GAS透析液樣品在4 ℃環境下至少能穩定放置24 h，GAS透析液樣品在-70 ℃冰凍環境下至少能穩定放置12周，反復凍融3次后仍保持穩定。體外增量法測得兩種型號微透析探針對GAS的回收率分別為19.97%和23.06%。

2.3 腦透析液中HBA測定方法的建立 HBA標準溶液配制：準確配制質量濃度為5 mg/mL的HBA對照品儲備液。用超純水將儲備液稀釋后，制成濃度為50、100、500、1 000、5 000、10 000 ng/mL的HBA標準工作液。

2.3.1 色譜條件 使用美國Waters公司symmetryShieldTMRP18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。選用了含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的水(A)-乙腈(B)系統作為流動相。檢測波長為220 nm。采用梯度洗脫過程。起始比例為A∶B=90∶10，0 min開始，B相以勻速從10%上升到73%(0～2 min)，維持該比例7 min(2～9 min)，9 min起B相比例在1 min內回復到起始的10%，最后A∶B=90∶10水平維持5 min，整個分析時間為15 min，梯度流速恒定為0.22 mL/min，柱溫為25 ℃，取腦透析液樣品20 μL，加入20 μL超純水，混勻，進樣量20 μL。HBA對照品的保留時間為6.61 min。

2.3.2 方法的專屬性 將HBA對照品液加入空白腦透析液中的色譜圖(圖2A)與空白腦透析液色譜圖(圖2B)進行比較。可見基線噪音較小，HBA峰形良好，無雜質峰干擾。說明本方法具有較高的專屬性。

圖2 色譜圖

2.3.3 線性關系考察 配制濃度為5.0、10、50、100、500、1 000 ng/mL的標準溶液測定。以樣品峰面積和樣品的濃度做線性回歸得到標準曲線，權重系數為1/X，線性范圍為5～1 000 ng/mL，回歸方程Y=167.3X-859.4，r=0.999 8。

2.3.4 檢測限和定量限 分別以信噪比S/n=3∶1和S/n=10∶1計。在腦透析液中，最低檢測限和定量限分別約為0.310 ng/mL和1.030 ng/mL。

2.3.5 回收率與精密度 配制5.0、50、500 ng/mL3個濃度的HBA質控樣品，考察HBA回收率與精密度。各質控日內日間精密度RSD%均小于2%，相對回收率(%)分別為(100.4±1.4)、(99.9±1.3)和(100.7±1.2)。

2.3.6 穩定性考察 HBA透析液樣品在4 ℃環境下至少能穩定放置24 h，HBA透析液樣品在-70 ℃冰凍環境下至少能穩定放置12周，反復凍融3次后仍保持穩定。體外增量法測得兩種型號探針對HBA的回收率分別為18.76%和23.31%。

2.4 實驗結果 皮下給藥后不同腦區內(mPFC、NAC、HIP)GAS和HBA藥時曲線的比較見圖3。

圖3 大鼠皮下給予GAS 10、30、50 mg/kg后，各腦區GAS和HBA的濃度-時間(C-T)曲線圖

口服給藥50 mg/kg GAS后，不同腦區內(mPFC、NAC、HIP)GAS和HBA藥時曲線的比較見圖4。

圖4 大鼠口服給予50 mg/kg GAS后，各腦區GAS和HBA的濃度-時間(C-T)曲線圖

由結果可見，GAS皮下給藥后，腦內藥物濃度呈劑量相關性，但總體腦內濃度很低，給藥1～2 h內達最高濃度，3個腦區內的藥物分布不存在顯著差異。口服給藥后，透過血腦屏障的藥物量略高于皮下給藥。各腦區藥物分布無顯著差異，腦內藥物峰濃度平均值與體內藥動學試驗中體內藥物峰濃度相比，占體內藥物濃度的比例低于0.2%。可見，GAS的血腦屏障透過率極低。GAS皮下給藥后，腦內HBA濃度與給藥量呈劑量相關性，給藥90 min內達最高濃度，3個腦區內的藥物分布不存在顯著差異。灌胃給藥后，大鼠腦內HBA于給藥后90 min達峰，各腦區分布NAC中較mPFC與NAC中略低但差異不大。無論皮下給藥還是灌胃給藥，腦內HBA濃度均顯著高于GAS濃度水平(P<0.001)。

3 討論

本文建立了靈敏準確的GAS和HBA定量檢測方法，配合微透析取樣技術對大鼠不同腦區的原型藥物GAS及其主要活性代謝產物HBA進行了連續檢測。

大鼠皮下給予GAS后，30 min高劑量組能夠檢出GAS，而低劑量組幾乎檢測不到GAS的存在，1～2 h內腦內各腦區的GAS都達到最高濃度，各劑量組腦中藥物濃度亦呈劑量相關性，但各腦區內含量都很低，各腦區之間無顯著差異。灌胃給藥后，GAS在各腦區內于1.5 h達峰，峰濃度略高于皮下給藥，但仍然低于100 ng/mL。灌胃給藥GAS血中的達峰時在0.5 h以內，可見腦內達峰時滯后較長時間。腦內峰濃度與同劑量血中峰濃度相比，低于0.2%。說明GAS雖然能夠透過血腦屏障，但透過率很低。

建立了HBA的腦內透析液中的測定方法，結果發現，給予GAS后，腦內HBA的含量是GAS含量的6～10倍。皮下給藥時，30 min各劑量組都能測得HBA的存在，1.5 h腦內HBA達峰，各腦區之間差異無統計學意義，這與皮下給藥后腦內DA和ACh的升高峰值時間相符合，說明GAS給藥后產生的腦內神經遞質調節作用可能與其代謝產物HBA入腦及其活性有關。

灌胃給予GAS后，腦內HBA在各腦區的分布均勻，達峰時約為1.5 h，同樣滯后于血中藥物達峰時，可能是由體內代謝過程和透過血腦屏障的過程造成其達峰時的滯后。

微透析技術在腦內藥物濃度研究過程中具有連續取樣動態監測的優勢，但限于其取樣量低、探針回收率低等缺點，導致其測得的藥物濃度絕對量可能存在誤差。因此，本文僅針對數據的相對變化趨勢及相對量進行比較。另外，由于微透析取樣為階段取樣(30 min)，因此，各時間點藥物濃度反映的實際為此時間點之前30 min內的平均濃度[8]。

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Microdialysis and HPLC method for the determination of gastrodin and gastrodigenin in rat brain

Lü Yun-feng

(Center for Medical Device Evaluation,SFDA,Beijing 100044,China)

Objective To detect the level of gastrodin and its metabolites gastrodigenin in rat brain dialysate after subcutaneous or oral administration of different doses of gastrodin.Methods Gastrodin in rat brain dialysate was determined by HPLC-MS/MS method and gastrodigenin was determined by HPLC-diode array detector method.Results The gastrodin levels in different rat brain regions for both subcutaneous and oral administration were low while the concentration of gastrodigenin in rat brain was significantly higher than gastrodin.Conclusion The results show that gastrodin could hardly pass through the blood-brain barrier,but its active metabolites gastrodigenin has a greater ability to penetrate the blood-brain barrier and play a role in brain.

Gastrodin;Gastrodigenin;LC-MS/MS;HPLC-diode array detector;Microdialysis

2013-06-03

國家食品藥品監督管理局醫療器械技術審評中心，北京 100044