污泥發酵液對A2O脫氮除磷和微生物的影響

劉亞利，袁一星，李 欣，詹技靈，康曉榮，董林沛

（1.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，150090哈爾濱；2.大連邁克環境科技有限公司，遼寧大連116000）

污泥發酵液對A2O脫氮除磷和微生物的影響

劉亞利1，袁一星1，李 欣1，詹技靈2，康曉榮1，董林沛1

（1.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，150090哈爾濱；2.大連邁克環境科技有限公司，遼寧大連116000）

為研究剩余污泥發酵液作碳源對微生物群落結構的影響，將發酵液與市政污水按流量比1∶35回用于厭氧-缺氧-好氧反應器，在室溫下運行90 d.聚類分析表明，發酵液明顯改變了微生物群落結構，5～30 d和45～90 d的微生物屬于不同的聚集區；微生物多樣性分析表明，發酵液使Shannon-Wiener指數從2.6升高到3.1，系統運行穩定性增強；PCR-DGGE分析表明，發酵液對微生物群落具有一定的選擇性，氨氧化菌Nitrosomonas sp.、硝化菌Betaproteobacteria和Nitrospira sp.、反硝化菌Comamonas sp.和聚磷菌Gammaproteobacteria得到富集，TN和TP去除率從64.5%和52.4%提高到84.7%和94.3%.

剩余污泥；脫氮除磷；碳源；生物群落；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術

最近的研究表明，剩余污泥厭氧發酵產生的揮發酸是脫氮除磷的良好碳源［1-2］，且剩余污泥發酵液比乙酸鹽更適合作為脫氮除磷的碳源［3］. Gao等［4］發現將剩余污泥發酵液應用于厭氧-缺氧-好氧（A2O）工藝后，TN和TP的去除率達80.1%和90.0%；Tong等［5］的研究表明，剩余污泥堿發酵液與市政污水按1∶35投入SBR反應器后，總氮（TN）和磷酸鹽（PO43--P）的去除率分別由63.3%和44.0%提高到83.2%和92.9%.為進一步研究污泥發酵液提高污水脫氮除磷效果的機理，Ji等［6］采用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術研究污泥發酵液和乙酸鹽對SBR中脫氮除磷功能菌的影響，發現污泥發酵液能夠促進短程硝化-反硝化和反硝化除磷反應發生，節省碳源，提高合成廢水的脫氮除磷效果.Zhu等［7］通過FISH技術研究發現:在厭氧-低溶解氧工藝中，剩余污泥堿發酵液能夠增加將氧化二氮（N2O）直接還原為氮氣（N2）的微生物量，減少N2O和一氧化氮（NO）產生，提高TP和TN去除效率，降低氧氣消耗.

本實驗從實際應用的角度出發，將剩余污泥發酵液作為內碳源與市政污水按比例混合后，回用于A2O反應器.考察投加發酵液對微生物群落結構的影響，分析微生物群落結構與工藝脫氮除磷效能之間的關系.同時采用PCR-DGGE技術分析投加發酵液前后脫氮除磷功能菌群的變化.

1 實 驗

1.1 實驗材料

剩余活性污泥取自哈爾濱某污水廠二沉池，經超聲（0.6 W／mL；5 min）和堿（pH=12）聯合預處理后厭氧發酵5 d，所得發酵液于10 000 r／min離心10 min，再通過鳥糞石法去除氮和磷［8］.所得污泥發酵液的性質如下:COD 8 120 mg／L；TN 256.3 mg／L；氨氮（-N）38.1 mg／L；總磷（TP）47.2 mg／L；28.7 mg／L；揮發酸（VFAs）5 061 mg／L；溶解性蛋白279 mg／L；溶解性多糖91 mg／L.其中VFAs中乙酸、丙酸所占的質量分數分別為38.2%和30.6%.

1.2 實驗裝置

污水處理工藝流程如圖1所示.A2O反應器的厭氧、缺氧和好氧池的水力停留時間分別為2，2和6 h.缺氧和好氧池的溶解氧分別控制在0.5～1.0和3.0～3.5 mg／L.混合液懸浮固體質量濃度（MLSS）為（4 000±500）mg／L，污泥停留時間為15 d.反應器在室溫下連續運行90 d.從第20天開始將污泥發酵液與市政污水按1∶35［5］投加到反應器中，投加前后進水水質見表1.

圖1 A2O處理工藝流程

表1 投加污泥發酵液前后進水水質

1.3 檢測方法

1.4 數據分析

1.4.1 工藝運行穩定性分析

采用出水COD、TN和TP的標準差（Ds）來衡量不同階段出水的波動，進而對工藝運行穩定性進行評價.Ds的計算式為

式中:Ds為COD、TN或TP標準差，mg／L；xi為第i個出水樣品的COD、TN或TP質量濃度，mg／L；ˉx為出水COD、TN或TP質量濃度平均值，mg／L；n為數據個數.

1.4.2 生物信息學分析

微生物種群多樣性采用Shannon指數（Shannon-Wiener index，H）［12］表示，用來評價系統內微生物種群的豐富程度及分配均勻性，即

式中:Pi為條帶i所占比例；t為條帶數．

2 結果和討論

2.1 工藝運行效果分析

投加發酵液前后，COD、TN和TP去除率隨時間的變化如圖2所示.與市政污水相比，投加發酵液使進水COD升高了220.4 mg／L，但COD去除率仍由86.7%提高到89.2%.這是因為增加的COD以VFAs、溶解性蛋白和多糖為主，能夠在A2O反應器中得到完全降解.該結果與發酵液作為SBR反應器碳源所得的結論一致［5］.在進水TN和TP質量濃度略有升高的條件下，發酵液使TN和TP去除率由64.5%和52.4%提高到84.7%和94.3%.這是因為:發酵液中富含的VFAs為聚磷菌提供了最佳碳源［14］；發酵液使碳氮比由4.1升高到9.0，削弱了反硝化菌和聚磷菌對有限碳源的競爭［3］.

圖2 COD、TN和TP去除率隨時間的變化

投加發酵液前后，反應器出水COD、TN和TP的標準差如表2所示.發酵液使出水COD、TN和TP的標準差均呈現先升高后降低的趨勢，表明工藝的運行穩定性先降低后提高.這是因為發酵液改變了進水水質，進而影響了微生物群落結構，經過25 d的馴化期后，適應新水質的微生物群落結構達到穩定，工藝運行穩定性提高.

表2 出水COD、TN和TP標準差隨發酵液的變化mg·L-1

2.2 微生物相似性分析

投加發酵液前后，反應器內活性污泥樣品的DGGE圖譜如圖3所示.可以看出，發酵液導致條帶數量和強度均發生了明顯改變.20～45 d時條帶數減少，45～90 d時條帶數增加.同時，隨著發酵液的投加，條帶11，12，14，15，16，17，18和19明顯增強；條帶4和8逐漸減弱，直至消失.

圖3 PCR產物變性梯度凝膠電泳

為進一步研究微生物群落之間的關系，采用聚類分析對污泥樣品中的微生物相似性進行分析.由圖4可見，不同進水條件的微生物大致分為3類:接種污泥樣本（1 d）聚為一類；市政污水作為進水時的污泥樣本（5～30 d）聚為一類；發酵液和市政污水混合液作為進水時的污泥樣本（45～90 d）聚為一類.這說明進水水質對微生物群落具有一定的選擇性，進水水質發生改變，種群相似性明顯降低.

圖4 污泥樣品的DGGE圖譜的聚類分析

2.3 微生物多樣性分析

投加發酵液前后，微生物Shannon-Wiener指數的變化如圖5所示.可以看出，投加發酵液后，Shannon-Wiener指數呈先降低后升高的趨勢，這是進水水質對細菌種群篩選的結果.一方面，不能適應水質變化的種群被淘汰，Shannon-Wiener指數降低；另一方面，投加發酵液前未檢出的部分種群（＜1%）逐漸適應水質變化，隨工藝運行得到積累，Shannon-Wiener指數升高.

圖5 Shannon-Wiener指數隨發酵液的變化

結合圖2、表2和圖5發現，微生物多樣性影響工藝的脫氮除磷效能和運行穩定性［14］.與0～20 d相比，45～90 d時Shannon-Wiener指數從2.6升高至3.1，TN和TP去除率由64.5%和52.4%提高到84.7%和94.3%.同時，45～90 d時Shannon-Wiener指數的變化幅度僅為0.06，TN和TP的標準差降至0.61和0.05，工藝運行穩定性提高.

2.4 測序結果分析

對19條主要條帶進行提取、擴增、克隆和測序，將所得的基因序列與NCBI中已鑒定同源性最接近的序列進行比對，其同源性達97%～100%，如表3所示.結合圖3和表3發現，條帶8對應的氨氧化菌Nitrosospira sp.不能適應進水水質變化而被淘汰，而條帶15對應的氨氧化菌Nitrosomonas sp.則隨污泥發酵液投加而增強，這與前人的研究結果一致［6］.據報道，當污泥發酵液使SBR反應器中腐殖酸達70.5 mg／g時，會造成亞硝酸鹽積累，抑制硝化菌Nitrospira sp.生長［6］，而本實驗中條帶12和17所對應的硝化菌Betaproteobacteria和Nitrospira sp.逐漸增加，表明反應器中未發生明顯的亞硝酸鹽積累.隨著進水被轉化為硝酸鹽，條帶11所對應的反硝化菌Comamonas sp.［15］得以生長，提高了TN的去除效率.投加發酵液后，條帶18所對應的聚磷菌Gammaproteobacteria［16］發生積累，而條帶4所對應的聚糖菌CandidatusCompetibacter phosphatis則逐漸消失，表明除磷效果增強.這可能是因為進水中含有乙酸和丙酸，且其比例為5∶4，更有利于促進聚磷菌積累［17］；另外，聚糖菌因缺少充足的亞硝酸鹽而失去與聚磷菌的競爭力［18］，與Ji等［6］的研究不同的是:條帶1所對應的聚磷菌Candidatus Accumulibacter sp.在反應器運行穩定時消失，這一方面是因為本實驗進水為市政污水而非合成廢水，水質復雜、波動大［19］；另一方面是因為該細菌更易以亞硝酸鹽而非硝酸鹽作為電子受體進行代謝［20］.同時，條帶16和19的相似菌Actinobacteria和Trichococcus sp.能夠在厭氧條件下分別將蛋白和多糖降解為乙酸和丙酸，有利于強化生物除磷過程［21］.在本實驗中，條帶14對應的Sphingobacteriaceae隨發酵液的應用而逐漸增強.該細菌已被鑒定為生物強化除磷工藝（EBPR）中的反硝化聚磷菌［22］，但其在本實驗中的代謝機理和功能需要通過FISH等更精確的分子生物學手段來探索.

表3 細菌克隆在NCBI庫最為相似的細菌種類

3 結 論

1）發酵液明顯改變了微生物群落結構，5～30 d和45～90 d的微生物屬于不同的類群.

2）發酵液使Shannon-Wiener指數從2.6升至3.1，出水TN和TP的標準差降至0.61和0.05，工藝運行穩定性提高.

3）發酵液對微生物群落具有一定的選擇性，氨氧化菌Nitrosomonassp.、硝化菌Betaproteobacteria和Nitrospira sp.、反硝化菌Comamonas sp.和聚磷菌Gamma proteobacteria得到富集，TN和TP去除率從64.5%和52.4%提高到84.7%和94.3%.

參考文獻

［1］COKGOR E U，OKTAY S，TAS D O，et al.Influence of pH and temperature on soluble substrate generation with primarysludgefermentation［J］.Bioresource Technology，2009，100（1）:380-386.

［2］彭晶，郭澤沖，侯玲玲，等.熱堿預處理對剩余污泥發酵產酸效能提升的影響［J］.哈爾濱工業大學學報，2012，44（8）:43-47.

［3］SOARE A，KAMPAS P，MAILLARD S，et al.Comparison between disintegrated and fermented sewage sludge for production of a carbon source suitable for biological nutrient removal［J］.Journal of Hazardous Materials，2010，175（1／2／3）:733-739.

［4］GAO Yongqing，PENG Yongzhen，ZHANG Jingyu，et al.Biological sludge reduction and enhanced nutrient removal in a pilot-scale system with 2-step sludge alkaline fermentation and A2O process［J］.Bioresource Technology，2011，102（5）:4091-4097.

［5］TONG Juan，CHEN Yinguang.Recovery of nitrogen and phosphorus from alkaline fermentation liquid of waste activated sludge and application of the fermentation liquidtopromotebiologicalmunicipalwastewater treatment［J］.Water Research，2009，43（12）:2969-2976.

［6］JI Zhouying，CHEN Yinguang.Using sludge fermentation liquidtoimprovewastewatershort-cutnitrificationdenitrification and denitrifying phosphorus removal via nitrite［J］.Environmental Sscience＆Ttechnology，2010，44（23）:8957-8963.

［7］ZHU Xiaoyu，CHEN Yinguang.Reduction of N2O and NO generation in anaerobic-aerobic（low dissolved oxygen）biological wastewater treatment Process by using sludge alkaline fermentation liquid［J］.Environmental Science＆Technology，2011，45（6）:2137-2143.

［8］佟娟.剩余污泥堿性發酵產生的短鏈脂肪酸作為生物脫氮除磷碳源的研究［D］.上海:同濟大學，2008.

［9］魏復盛，國家環境保護總局，水和廢水監測分析方法編委會.水和廢水監測分析方法［M］.北京:中國環境科學出版社，2002.

［10］LOWRY O H，ROSEBROUGH N J，FARR A L，et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.J Bbiol Chem，1951，193（1）:265-275.

［11］HERBERT D，PHILIPPS P J，STRANGE R E. Carbohydrate analysis［J］.Methods Enzymol B，1971，5:265-277.

［12］WANG Aijie，SUN Dan，CAO Guangli，et al.Integrated hydrogen production process from cellulose by combining dark fermentation，microbial fuel cells，and a microbial electrolysis cell［J］.Bioresource Technology，2011，102（5）:4137-4143.

［13］KANG Xiaorong，ZHANG Guangming，CHEN Lin，et al. EffectofinitialpHadjustmentonhydrolysisand acidification of sludge by ultrasonic pretreatment［J］. Industrial＆Engineering Chemistry Research，2011，50（22）:12372-12378.

［14］OEHMEN A，LOPEZ V C M，CARVALHO G，et al. Modellingthepopulationdynamicsandmetabolic diversity of organisms relevant in anaerobic／anoxic／aerobicenhancedbiologicalphosphorusremoval processes［J］.Water Research，2010，44（15）:4473-4486.

［15］ZHANG Bin，SUN Baosheng，JI Min，et al.Quantification and comparison of ammonia-oxidizing bacterial communities in MBRs treating various types of wastewater［J］. Bioresource Technology，2010，101（9）:3054-3059.

［16］LIU Xinchun，ZHANG Yu，YANG Min，et al.Analysis of bacterial community structures in two sewage treatment plants with differentsludgepropertiesandtreatment performance by nested PCR-DGGE method［J］.Journal of Environmental Sciences，2007，19（1）:60-66.

［17］GUERRERO J，GUISASOLA A，BAEZA J A.The nature of the carbon source rules the competition between PAOanddenitrifiersinsystemsforsimultaneous biological nitrogen and phosphorus removal［J］.Water Research，2011，45（16）:4793-4802.

［18］TAYA C，GARLAPATI V K，GUISASOLA A，et al. The selective role of nitrite in the PAO／GAO competition［J］.Chemosphere，2013，93（4）:612-618.

［19］WONG M T，MINO T，SEVIOUR R，et al.In situ identificationandcharacterizationofthemicrobial community structure of full-scale enhanced biological phosphorous removalplantsinJapan［J］.Water Research，2005，39（13）:2901-2914.

［20］GUISASOLA A，QURIE M，VARGAS M DEL M，et al. Failure of an enriched nitrite-DPAO population to use nitrateasanelectronacceptor［J］.Process Biochemistry，2009，44（7）:689-695.

［21］WU Guangxue，SORENSEN K，RODGERS M，et al. Microbial community associated with glucose-induced enhanced biological phosphorus removal［J］.Water Science＆Technology，2009，60（8）:2105-2113.

［22］李偉光，田文德，康曉榮，等.強化生物除磷工藝微生物種群結構分析［J］.化工學報，2011，62（12）: 3532-3538.

（編輯 劉 彤）

The effect of sludge fermentation liquid on nutrient removal performances and microbial community structure in A2O process

LIU Yali1，YUAN Yixing1，LI Xin1，ZHAN Jiling2，KANG Xiaorong1，DONG Linpei1
（1.School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China；2.Dalian MEC Environmental Technology＆Engineering Co.，Ltd，116000 Dalian，Liaoning，China）

To analyze the effect of sludge fermentation liquid，using as internal carbon source，on microbial community structure in anaerobic-anoxic-aerobic process，three-month-long operational experiment was conducted at flow ratio of fermentation liquid and domestic wastewater 1∶35 at room temperature.The clustering analysis indicated that the microbial community structure was changed significantly by fermentation liquid，and the microbes of 5-30 d and 45-90 d had quite different homology.The microbial diversity analysis demonstrated that the Shannon-Wiener index increased from 2.6 to 3.1，resulting in the enhancement of operational stability.Meanwhile，fermentation liquid appeared to be selective for ammonia-oxidizing bacteria Nitrosomonas sp.，nitrifying bacteria Betaproteobacteria and Nitrospira sp.，denitrifying bacteria Comamonas sp.and phosphorus-accumulating bacteria Gammaproteobacteria，which led to the TN and TP removal efficiency improved from 64.5%and 52.4%to 84.7%and 94.3%，respectively.

waste activated sludge；nutrient removal；carbon source；bacterial community；PCR-DGGE

TU992.3

A

0367-6234（2014）10-0042-05

2013-09-12.

國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（2012AA063503-02）.

劉亞利（1982—），女，博士研究生；

袁一星（1957—），男，教授，博士生導師.

袁一星，yyx1957＠163.com；

李 欣，lixinwindows＠163.com.