重慶地區(qū)兒童急性腹瀉相關(guān)博卡病毒的基因類型及其流行特征調(diào)查

趙 進(jìn)，黃豆豆，李思思，郭辰濤，許紅梅，張小愛，劉 瑋

重慶地區(qū)兒童急性腹瀉相關(guān)博卡病毒的基因類型及其流行特征調(diào)查

趙 進(jìn)1，黃豆豆1，李思思1，郭辰濤1，許紅梅2，張小愛1，劉 瑋1

目的了解重慶地區(qū)急性腹瀉患兒博卡病毒(human bocavirus, HBoV)的基因型和流行特征，為HBoV相關(guān)腹瀉的防控提供依據(jù)。方法以重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院為哨點(diǎn)醫(yī)院，收集2011年急性腹瀉兒童患者的糞便樣本504份，使用熒光定量PCR篩選陽性標(biāo)本，使用巢氏PCR方法對(duì)陽性標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行序列比對(duì)并建立進(jìn)化樹進(jìn)行基因分型。結(jié)果504份腹瀉標(biāo)本中，49份為HBoV陽性，陽性率為9.72%。不同季節(jié)HBoV的檢出率不同，夏季檢出率(19.72%)最高(P=0.003)。序列比對(duì)和進(jìn)化樹結(jié)果提示49份HBoV陽性標(biāo)本中，HBoV1、HBoV2和HBoV3的例數(shù)分別25、23和1，其中檢出的23份HBoV2全部為HBoV-2B型。結(jié)論不同季節(jié)HBoV的檢出率不同，其中夏季病毒檢出率最高；重慶地區(qū)檢出的 HBoV以HBoV1型和HBoV2B型為主。

博卡病毒；急性兒童腹瀉；調(diào)查研究；基因型

人博卡病毒(human bocavirus, HBoV)屬于細(xì)小病毒科，是最近發(fā)現(xiàn)的可以引起人類急性胃腸炎的新發(fā)病原體[1]。HBoV無包膜，衣殼蛋白呈二十面體對(duì)稱，蛋白內(nèi)包含一條長為5300 bp的線性單鏈DNA，主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NP1，結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2[2]。目前，國內(nèi)缺乏重慶地區(qū)兒童急性腹瀉相關(guān)HBoV的研究[3-5]。本研究以重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院作為監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院，對(duì)2011-01到2011-12急性腹瀉的兒童進(jìn)行HBoV的調(diào)查研究，以了解重慶地區(qū)兒童腹瀉相關(guān)HBoV的型別及其流行特征。

1 材料和方法

1.1 病例定義 按照WHO對(duì)于急性腹瀉的定義納入研究對(duì)象：24 h內(nèi)有3次及3次以上的水樣便或者稀便，腹瀉持續(xù)時(shí)間小于2周。同時(shí)排除炎性胃腸道疾病、脂泄病、囊胞性纖維病、食物中毒或者有明顯的呼吸系統(tǒng)癥狀和體征者[3]。

1.2 標(biāo)本采集與檢測(cè) 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例經(jīng)知情同意后，采集患者急性期糞便標(biāo)本。樣本使用PBS進(jìn)行1∶10稀釋后取200 μl腹瀉稀釋液提取核酸。病毒核酸的提取使用QIAamp? MinElute? Virus Spin Kit (Cat.NO. 57704)試劑盒。熒光定量PCR篩選HBoV陽性標(biāo)本，引物分別為HBoV1r和HBoV1f。陽性標(biāo)本使用巢氏PCR擴(kuò)增博卡病毒核酸長度為454 bp的NS1片段。第一輪引物為HBoV2-sf1 (AACAGATGGGCAAGCAGAAC) 和HBoV2-sr1 (AGGACAAAGGTCTCCAAGAGG)； 第二輪引物為HBoV2-sf2 (TGCTTCAACAGGCAAAACAA) 和 HBoV2-sr2 (TCCAAGAGGAAATGAGTTTGG)[6]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，并從GenBank下載國內(nèi)外HBoV的參考株序列，使用MEGA 5.1 建立進(jìn)化樹，確定博卡病毒的基因型。

1.3 信息收集 使用標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查問卷，由臨床醫(yī)師對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例從病歷中抽取相關(guān)信息，主要包括患者年齡、性別、出生日期和發(fā)病日期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)錄入使用Epidata 3.0 錄入數(shù)據(jù)，建立腹瀉數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0。不同組兒童之間HBoV檢出率的比較使用卡方檢驗(yàn)或者Fisher檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 流行狀況 共收集腹瀉標(biāo)本504份，其中49份為HBoV陽性，陽性率為9.72%。不同性別之間HBoV的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.656)。不同年齡段之間HBoV的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.280)。

不同季節(jié)的HBoV的檢出率不同，夏季HBoV的檢出率最高，秋季HBoV的檢出率最低(P=0.003，表1)。

2.2 病毒分型及其基因特征 根據(jù)BLAST比對(duì)和NS1核酸序列進(jìn)化樹的結(jié)果(圖1)，檢測(cè)到的HBoV分為3型，HBoV1 和HBoV2最多，HBoV3最少，僅1株。重慶地區(qū)腹瀉HBoV1與呼吸道的HBoV1有很高的同源性(98%～100%)。檢測(cè)到HBoV2屬于HBoV-2B型，與FJ375129/Shanghai和FJ973559/Nigeria在進(jìn)化樹上有很高的同源性。檢測(cè)到1株HBoV3型病毒，與病毒株JN086998/USA的同源性高達(dá)100%(表2)。

表1 2011年重慶地區(qū)HBoV感染兒童的性別、年齡和季節(jié)分布

圖1 2011年重慶地區(qū)HBoV感染NS1區(qū)核酸序列進(jìn)化樹

表2 重慶地區(qū)不同HBoV基因型的檢出率和組內(nèi)同源性

3 討 論

急性腹瀉是5歲以下兒童的常見疾病，具有很高的發(fā)病率和病死率。世界范圍內(nèi)每年有超過7億5歲以下兒童發(fā)生急性腹瀉，超過200萬兒童死于急性腹瀉，占兒童死亡人數(shù)的19%[6- 8]。HBoV是最近發(fā)現(xiàn)的可以引起人類急性胃腸炎新發(fā)病原體，分為4個(gè)型，分別為HBoV1-4型，HBoV2型又進(jìn)一步分為HBoV2A和HBoV2B兩個(gè)組[1,9,10]。HBoV1主要從呼吸道檢測(cè)出，HBoV2主要從糞便樣本中檢測(cè)出，HBoV3和HBoV4只是偶爾被檢測(cè)到[1,11]。 HBoV在世界范圍內(nèi)腹瀉的檢出率為0.8%～25.6%[2-5,10,11]。我國首次于上海地區(qū)2008年腹瀉標(biāo)本中檢測(cè)到HBoV2，其HBoV1和HBoV2的檢出率分別為5.3%和5.0%；我國首次從北京兒童醫(yī)院2006-2007年的腹瀉樣本檢測(cè)到兩株HBoV3，另外HBoV1、HBoV2和HBoV3的檢出率分別為2.5%、9.5%和0.5%。蘭州地區(qū)是HBoV2的高發(fā)地區(qū)，HBoV1、HBoV2和HBoV3的檢出率分別為4.3%、20.4%和0.9%；蘇州地區(qū)HBoV的檢出率為6.1%[3-5,10]。但是，尚缺乏重慶地區(qū)兒童急性腹瀉相關(guān)HBoV的研究。在本次監(jiān)測(cè)中，重慶地區(qū)HBoV1、HBoV2和HBoV3的檢出率分別為4.96%，4.56%和0.20%，總HBoV的檢出率與上海地區(qū)相近，低于蘭州地區(qū)和北京地區(qū)[3-4,10]。重慶地區(qū)不同性別和年齡段腹瀉兒童的HBoV檢出率沒有差異。不同季節(jié)HBoV檢出率不同，夏季HBoV的檢出率最高，與廣州和蘇州地區(qū)調(diào)查研究報(bào)道的7～8月份為檢出率高峰基本一致[5]。

依據(jù)博卡病毒NS1片段建立進(jìn)化樹，對(duì)HBoV進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示，HBoV1和HBoV2B是腹瀉兒童患者最常見的基因型。HBoV1同組之間有很高的同源性，HBoV2同組之間也有很高的同源性，從同源性可以看出HBoV1和HBoV2的基因序列相對(duì)保守。重慶地區(qū)急性腹瀉樣本中，HBoV1是最主要的檢出基因型，與呼吸道檢出的HBoV1有很高的同源性(98.0%～100%)。HBoV2的檢出率僅低于HBoV1，在本研究中檢測(cè)到23株HBoV2全部屬于HBoV-2B型，并且與上海的FJ375129和尼日利亞的FJ973559有很高的同源性，而北京地區(qū)和蘇州地區(qū)的檢出的HBoV2為HBoV-2A型，提示不同地區(qū)的腹瀉患者感染的HBoV2型可能存在差異[3,5]。本研究同時(shí)還檢測(cè)到一株HBoV3，與美國的JN086998的同源性高達(dá)100%。

[1] Allander T, Tammi M T, Eriksson M,etal. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(36): 12891-12896.

[2] Khamrin P, Malasao R, Chaimongkol N,etal. Circulating of human bocavirus 1, 2, 3, and 4 in pediatric patients with acute gastroenteritis in Thailand [J]. Infect Genet Evol , 2012, 12(3): 565-569.

[3] Wang Y, Gonzalez R, Zhou H,etal. Detection of human bocavirus 3 in China [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011, 30(6): 799-805.

[4] Shan T L, Zhang W, Guo W,etal. The first detection of human bocavirus 2 infections in China [J]. J Clin Virol, 2009, 46(2): 196-197.

[5] 付建光, 蔣翠蓮, 秦圓方,等. 2010-2011年蘇州地區(qū)腹瀉嬰幼兒感染人博卡病毒的分子特征研究[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2013, 34(12): 1216-1218.

[6] Dennehy P H. Viral gastroenteritis in children[J]. Pediatr Infect Dis J, 2011, 30(1): 63-64.

[7] Guarino A, Dupont C, Gorelov A V,etal. The management of acute diarrhea in children in developed and developing areas: from evidence base to clinical practice [J]. Expert Opin Pharmacother, 2012, 13(1): 17-26.

[8] Ren Z, Kong Y, Wang J,etal. Etiological study of enteric viruses and the genetic diversity of norovirus, sapovirus, adenovirus, and astrovirus in children with diarrhea in Chongqing, China [J]. BMC Infect Dis, 2013,13:412.

[9] Kapoor A, Slikas E, Simmonds P,etal. A newly identified bocavirus species in human stool [J]. J Infect Dis, 2009, 199(2): 196-200.

[10] Jin Y, Cheng W X, Xu Z Q,etal. High prevalence of human bocavirus 2 and its role in childhood acute gastroenteritis in China [J]. J Clin Virol, 2011, 52(3): 251-253.

[11] Arthur J L, Higgins G D, Davidson G P,etal. A novel bocavirus associated with acute gastroenteritis in Australian children[J]. PLoS Pathog, 2009, 5(4): e1000391.

(2014-06-04收稿 2014-07-08修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

InvestigationofhumanbocavirusinpediatricpatientswithacutediarrheainChongqing,China

ZHAO Jin1, HUANG Doudou1, LI Sisi1, GUO Chentao1, XU Hongmei2, ZHANG Xiaoai1, and LIU Wei1.

1. State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China; 2. Department of Infection Gastroenterology,Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China

ObjectiveTo investigate the prevalence, genotypes and epidemic characteristics of human bocavirus associated with acute pediatric diarrhea in Chongqing area.MethodsPediatric patients with acute diarrhea were recruited and stool samples were collected in Children’s Hospital of Chongqing Medical University during 2011. Real-time PCR and nested PCR were performed to determine the presence of HBoV and their genotypes.ResultsA total of 504 stool specimens were collected, from which 49 HBoV positive samples were identified, with a detection rate of 9.72%. A seasonal distribution of HBoV was observed, with a peak (19.72%) in summer. No distribution of age or gender specific was obtained for the HBoV positive detection. Based on Blast and MEGA analysis, 25 HBoV1, 23 HBoV2 and 1 HBoV3 were determined. All the HBoV2 strains detected belonged to HBoV-2B genotype.ConclusionsThe detection rate of HBoV has obvious seasonality, with a peak in summer. HBoV1 and HBoV-2B are the major genotypes.

human bocavirus; acute pediatric diarrhea; investigation; genotype

國家十二五傳染病重大專項(xiàng) ( 2013ZX1004-202)，軍隊(duì)后勤科研基金課題(BWS11C073)

趙 進(jìn)，碩士研究生，E-mail: phage1@163.com

1.100071北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所；2.400014，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院

劉 瑋，E-mail: lwbime@163.com

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