大鼠血清網(wǎng)膜素-1水平與胰島素抵抗的相關(guān)性*

王楠楠， 趙曉娟△， 陳 薇， 白淑亭， 楊博文

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1內(nèi)分泌科， 2流行病科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

大鼠血清網(wǎng)膜素-1水平與胰島素抵抗的相關(guān)性*

王楠楠1， 趙曉娟1△， 陳 薇1， 白淑亭1， 楊博文2

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2流行病科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

目的： 建立胰島素抵抗大鼠模型，探討血清網(wǎng)膜素-1水平與胰島素抵抗的相關(guān)性。方法：30只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC，n=15)、高脂飲食組(HF，n=15)，自由攝食、飲水，NC組給予普通飼料，HF組給予高脂飼料誘導(dǎo)胰島素抵抗模型。10周后2組各取5只行高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)評(píng)估模型，ELISA法檢測(cè)血清網(wǎng)膜素-1，放射免疫法檢測(cè)血清基礎(chǔ)胰島素。結(jié)果：(1)各組大鼠基礎(chǔ)血糖比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。(2)HF組血清基礎(chǔ)胰島素水平較NC組明顯升高(P<0.05)，但血清網(wǎng)膜素-1水平較NC組明顯降低(P<0.01)。(3)Pearson相關(guān)性分析示血清網(wǎng)膜素-1分別與胰島素(r=-0.654，P<0.01)和游離脂肪酸(r=-0.446，P<0.05)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：在大鼠胰島素抵抗階段，血清網(wǎng)膜素-1水平已經(jīng)開(kāi)始降低；基礎(chǔ)胰島素水平隨著血清網(wǎng)膜素-1水平的降低而升高，推測(cè)血清網(wǎng)膜素-1水平降低可能成為胰島素抵抗、糖尿病及心血管疾病的早期提示因子。

胰島素抵抗； 高胰島素正葡萄糖鉗夾； 網(wǎng)膜素-1

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)不僅是糖尿病的病因之一，也是高血壓、血脂異常及動(dòng)脈粥樣硬化的共同危險(xiǎn)因素。近期研究表明，脂肪組織通過(guò)多種脂肪內(nèi)分泌激素，參與能量代謝、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等病理生理過(guò)程。網(wǎng)膜素-1(omentin-1)是特異性表達(dá)于網(wǎng)膜脂肪組織的細(xì)胞因子，可改善胰島素敏感性，參與胰島素抵抗相關(guān)的糖代謝調(diào)節(jié)[1]。在肥胖、糖尿病及多囊卵巢綜合征等患者體內(nèi)呈低表達(dá)水平[2-3]。隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜素-1還具有抗炎、舒張血管作用[4]。本文旨在探討大鼠血清網(wǎng)膜素-1水平與胰島素抵抗相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司)，體重(230±20)g，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)中，室溫21～25 ℃，濕度60%左右，明暗交替周期12 h，自由攝食、飲水。以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

胰島素放射免疫分析藥盒購(gòu)于原子高科股份有限公司；大鼠血清網(wǎng)膜素-1 ELISA試劑盒(R&D)檢測(cè)范圍為1.5 ng/L～400 ng/L；微量輸液泵；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀；紫外分光光度儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立胰島素抵抗大鼠模型 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC，n=15)和高脂飲食組(HF，n=15)。正常對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組給予高脂飼料喂養(yǎng)，誘導(dǎo)胰島素抵抗模型。基礎(chǔ)飼料熱量比：蛋白質(zhì)28.58%，脂肪9.59%，碳水化合物61.83%。高脂飼料配方如下：基礎(chǔ)飼料+豬油+奶粉，熱量比為蛋白質(zhì)14%，脂肪59%，碳水化合物27%。

2.2 高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物喂養(yǎng)10周以后，NC組、HF組隨機(jī)各抽取5只大鼠，采用高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，評(píng)估胰島素抵抗模型，具體方法參照文獻(xiàn)[5]實(shí)施。首先輸注胰島素，輸注率1.67 mU·kg-1·min-1，每5 min在頸動(dòng)脈取1滴血測(cè)血糖。當(dāng)血糖<基礎(chǔ)值±0.5 mmol/L時(shí)開(kāi)始輸注葡萄糖。葡萄糖輸注率(glucose infusion rate，GIR)從4～6 kg/min開(kāi)始，每5 min測(cè)血糖1次，調(diào)整GIR，使血糖保持在基礎(chǔ)值±0.5 mmol/L。連續(xù)3次血糖都在上述范圍內(nèi)，鉗夾形成。實(shí)驗(yàn)共計(jì)約2 h，計(jì)算60～120 min的平均GIR，以評(píng)價(jià)胰島素的敏感性。

2.3 標(biāo)本采集 在大鼠禁食14 h后，測(cè)定空腹血糖；予10%水合氯醛麻醉(腹腔注射)，內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，應(yīng)用胰島素放免藥盒檢測(cè)血清胰島素水平，ELISA法測(cè)定血清網(wǎng)膜素-1和游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平。鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剖殺動(dòng)物，心臟穿刺取血，分離血清，-70 ℃冰箱保存；完整剝離大鼠附睪脂肪，稱(chēng)重，計(jì)算附睪脂肪質(zhì)量占體質(zhì)量的比例(g/g)，即附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)。

2.4 ELISA法測(cè)定血清網(wǎng)膜素-1和FFA水平 實(shí)驗(yàn)前將試劑盒及血清樣品平衡至室溫，確定所需的酶標(biāo)包被板的數(shù)目，標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔及樣品孔均做復(fù)孔，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(A值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計(jì)算出相應(yīng)的樣品濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間各指標(biāo)均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠體重及附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)

附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)常用于評(píng)估內(nèi)臟脂肪含量，本實(shí)驗(yàn)大鼠喂養(yǎng)10周后，HF組較NC組體重、附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)明顯升高(P<0.01)，提示長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致的大鼠肥胖為內(nèi)臟脂肪性肥胖，見(jiàn)表1。

表1 高脂飲食對(duì)大鼠體重和附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)的影響

Table 1.Weight and epididymal fat mass index in NC group and HF group (Mean±SD.n=10)

GroupWeight(g)Epididymalfatmassindex(%)NC513.41±46.500.75±0.12HF585.23±32.64**1.12±0.10**

NC: normal control; HF: high-fat diet.**P<0.01vsNC.

2 高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)

喂養(yǎng)10周后行鉗夾實(shí)驗(yàn)，HF組大鼠平均GIR為(1.19±0.32) mg·kg-1·min-1，顯著低于NC組(3.95±0.31) mg·kg-1·min-1(P<0.01)，提示胰島素抵抗大鼠模型建立成功。

3 空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血清基礎(chǔ)胰島素(insulin,INS)和血清網(wǎng)膜素-1水平的變化

各組大鼠基礎(chǔ)血糖比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。HF組的血清基礎(chǔ)胰島素較NC組明顯升高(P<0.05)，血清網(wǎng)膜素-1明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)表2。

4 部分指標(biāo)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：血清網(wǎng)膜素-1分別與INS (r=-0.654,P<0.01)和FFA (r=-0.446,P<0.05)呈負(fù)相關(guān)，但血清網(wǎng)膜素-1與體重和附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性，見(jiàn)圖1。

表2 高脂飲食對(duì)大鼠FBG、INS、omentin-1 和FFA水平的影響

NC: normal control; HF: high-fat diet; FBG: fasting blood glucose; INS: insulin; FFA: free fatty acids.*P<0.05,**P<0.01vsNC.

Figure 1.The result of correlation analysis between omentin-1 with INS (A) and FFA (B).

圖1 Omentin-1與胰島素及FFA的相關(guān)分析

討 論

附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)常用于評(píng)估內(nèi)臟脂肪含量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高脂飲食組明顯高于正常飲食組，提示長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致的大鼠肥胖為內(nèi)臟脂肪性肥胖。相關(guān)研究表明，肥胖者葡萄糖利用障礙，胰島素抑制肝糖產(chǎn)生作用降低，游離脂肪酸代謝增高可影響葡萄糖的利用。上述均可導(dǎo)致胰島素抵抗，為滿足機(jī)體糖代謝需求，需分泌更多的胰島素造成高胰島素血癥，而高胰島素血癥可以使脂肪細(xì)胞合成增加，分解減少。因此，高胰島素血癥和高游離脂肪酸是肥胖者胰島素抵抗的重要特征，本研究測(cè)得IR大鼠的血清基礎(chǔ)胰島素、游離脂肪酸水平均明顯高于NC組，與這一特征一致。

網(wǎng)膜素的基因位于染色體1q22～23，這一區(qū)域是糖尿病致病基因的候選區(qū)[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其調(diào)節(jié)糖代謝的主要機(jī)制為促進(jìn)脂肪細(xì)胞胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取作用，并促進(jìn)胰島素受體后信號(hào)通路中的Akt磷酸化，即可增加脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性。因此隨著網(wǎng)膜素-1水平的降低胰島素敏感性下降，導(dǎo)致高胰島素血癥，進(jìn)而發(fā)生胰島素抵抗，促進(jìn)糖尿病及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖、多囊卵巢綜合征、糖耐量減低、1型糖尿病和2型糖尿病患者中，血清網(wǎng)膜素-1水平、網(wǎng)膜脂肪組織中網(wǎng)膜素-1的mRNA表達(dá)水平和蛋白含量均明顯降低，且網(wǎng)膜組織網(wǎng)膜素-1基因的表達(dá)和分泌受到胰島素和葡萄糖的抑制，并呈劑量依賴性[2-3, 6]。Wurm等[7]對(duì)12例正常體重、胰島素敏感的正常人進(jìn)行嚴(yán)格的OGTT試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜素-1與空腹和餐后的血糖水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性。上述研究表明，短時(shí)的葡萄糖攝取增多并未引起血清網(wǎng)膜素-1發(fā)生明顯波動(dòng)，但是持續(xù)的高血糖狀態(tài)及高胰島素水平對(duì)其基因表達(dá)與蛋白合成有下調(diào)作用[2-3, 6-7]。

在人群調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜素-1有比較一致的結(jié)果，我們期望進(jìn)一步研究這一現(xiàn)象的功能及機(jī)制，因此動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)相當(dāng)重要。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠10周后成功建立胰島素抵抗模型，測(cè)得IR組大鼠血清網(wǎng)膜素-1水平較NC組明顯減低，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果示血清網(wǎng)膜素-1與基礎(chǔ)胰島素呈明顯負(fù)相關(guān)，表明在大鼠胰島素抵抗階段，血清網(wǎng)膜素-1水平已經(jīng)開(kāi)始降低；胰島素水平越高，血清網(wǎng)膜素-1水平就越低，即胰島素敏感性隨著血清網(wǎng)膜素-1水平的降低而降低，這與人群研究一致[2-3]。當(dāng)血清網(wǎng)膜素-1水平降低時(shí)，提示高血糖狀態(tài)或高胰島素水平已經(jīng)維持了相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，推測(cè)血清網(wǎng)膜素-1水平降低可能成為IR、糖尿病及心血管疾病的早期提示因子。由于2型糖尿病患者早期可能沒(méi)有明顯的不適感覺(jué)，因此檢測(cè)網(wǎng)膜素-1水平，以期為早期診斷及臨床治療提供新思路。但也有相關(guān)研究認(rèn)為大鼠血清網(wǎng)膜素-1與胰島素抵抗呈正相關(guān)[8]，該實(shí)驗(yàn)同樣采取高脂飼料喂養(yǎng)，但可能由于高脂飼養(yǎng)配方不同、大鼠周齡不同、體重不同或?qū)嶒?yàn)誤差等原因出現(xiàn)結(jié)果的差異，因此需要更多的研究和探討。

綜上所述，血清網(wǎng)膜素-1作為目前已知的4個(gè)可增加胰島素敏感性的“有益”脂肪因子(脂聯(lián)素、內(nèi)脂素、vaspin和網(wǎng)膜素)之一[9]，可能通過(guò)調(diào)節(jié)代謝、改善胰島素抵抗、發(fā)揮抗炎作用及保護(hù)血管內(nèi)皮功能等機(jī)制參與肥胖、糖尿病、心腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。網(wǎng)膜素-1在體內(nèi)調(diào)控及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未完全闡明，深入研究其生物學(xué)功能及其機(jī)制，可為肥胖、糖尿病、心血管疾病及其并發(fā)癥等提供新的早期診斷指標(biāo)。

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Correlation of serum omentin-1 level and insulin resistance in rats

WANG Nan-nan1, ZHAO Xiao-juan1, CHEN Wei1, BAI Shu-ting1, YANG Bo-wen2

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofEpidemic,TheFirstHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:zhaoxiaojuan@medmail.com.cn)

AIM: To establish the insulin resistance rat model for evaluating the correlation of omentin-1 level and insulin resistance. METHODS: SPF male Wistar rats (n=30) were randomly divided into normal control group (NC,n=15) and high-fat diet group (HF,n=15). The rats in NC group were fed with basic diet. The insulin resistant model was established by feeding the rats with high-fat diet in HF group. After 10 weeks, 5 rats in each group were assessed by the technique of hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp. After the insulin resistant model was successfully established, the body weight and fasting blood glucose were detected. The concentration of fasting serum omentin-1 was analyzed by ELISA. Fasting serum insulin was measured by radioimmunoassay. RESULTS: No difference of fasting blood glucose between the 2 groups was observed. The level of fasting serum insulin in HF group was significantly higher than that in NC group (P<0.05). The level of serum omentin-1 in HF group were significantly decreased compared with NC group (P<0.01). Pearson’s correlation analysis showed that negative correlations between serum omentin-1 and fasting serum insulin (r=-0.654，P<0.01), serum omentin-1 and free fatty acid (r=-0.446，P<0.05) was found. CONCLUSION: In rats, serum omentin-1 level began to decrease at insulin resistance stage. As serum omentin-1 level decreased, the basal insulin level increased, indicating that decreased serum omentin-1 level may be an early factor of IR, diabetes and cardiovascular diseases.

Insulin resistance; Hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp; Omentin-1

1000- 4718(2014)12- 2276- 04

2014- 05- 26

2014- 10- 31

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2009225010-10)

R587

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.029

△通訊作者 Tel: 024-83283135; E-mail: zhaoxiaojuan@medmail.com.cn