CB2受體激動劑JWH133對百草枯中毒致急性肺損傷大鼠的保護作用*

劉振寧， 韓 軍， 鄭 強， 趙 敏

(中國醫科大學附屬盛京醫院急診科，遼寧 沈陽 110004)

CB2受體激動劑JWH133對百草枯中毒致急性肺損傷大鼠的保護作用*

劉振寧， 韓 軍， 鄭 強， 趙 敏△

(中國醫科大學附屬盛京醫院急診科，遼寧 沈陽 110004)

目的： 研究大麻素CB2受體激動劑JWH133對百草枯中毒致急性肺損傷大鼠的保護作用。方法: 72只SD雄性大鼠隨機平均分成4組。百草枯中毒組：按照20 mg/kg劑量腹腔注射；低劑量JWH133預處理組：在給予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射5 mg/kg JWH133；高劑量JWH133預處理組：在給予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射20 mg/kg JWH133；正常對照組：1 mL生理鹽水腹腔注射。在注射百草枯后8 h、1 d和3 d時，收集動脈血、肺泡灌洗液和肺組織標本。采用血氣分析儀測定動脈血氧分壓(PaO2)，采用ELISA方法檢測支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量，行組織切片HE染色進行肺損傷評分，利用Western blotting方法檢測肺組織中NF-κB和AP-1 蛋白表達水平。結果: 與正常對照組相比，百草枯中毒組大鼠的動脈血PaO2明顯下降，肺組織結構破壞，肺泡間質水腫，肺損傷指數增加，支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞因子IL-1β和TNF-α含量明顯增加。JWH133預處理，尤其是高劑量JWH133可以減輕肺組織損傷程度，降低支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量，減少肺組織中NF-κB和AP-1 蛋白的表達。結論: 應用CB2受體激動劑JWH133可以抑制百草枯中毒大鼠肺組織中NF-κB和AP-1 蛋白的表達，減少炎性細胞因子IL-1β和TNF-α的分泌，減輕百草枯中毒導致的急性肺損傷。

百草枯； 急性肺損傷； 大麻素CB2受體； 核因子κB； 激活蛋白1

百草枯(paraquat,PQ)是目前我國農業應用廣泛的除草劑之一。在臨床上，自殺性口服百草枯中毒患者較多，其病死率可達到60%～80%[1]，成為致死性最高的農藥中毒事件。百草枯化學結構與多胺結構十分相似，所以百草枯很容易被肺組織中的多胺攝取系統[2]所攝取，并通過氧化應激以及炎癥反應損傷肺泡上皮細胞，破壞肺泡組織結構，炎性細胞浸潤，急性期患者臨床上表現為呼吸衰竭甚至多器官功能障礙[3]。

百草枯進入體內后，除了氧化應激反應以外，免疫細胞的激活以及炎性細胞因子分泌等炎癥反應是肺損傷的重要因素。百草枯可以激活免疫細胞，激活炎癥反應關鍵調控因子——核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)[4]和激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)[5]，導致下游的炎細胞因子表達增加。大麻素CB2受體(cannabinoid CB2 receptor)為G蛋白偶聯受體，主要分布于外周免疫系統，能夠激活多種信號通路。在骨性關節炎[6]、動脈粥樣硬化[7]以及缺血再灌注損傷[8]過程中，CB2受體的激活參與抑制免疫細胞的活化、增殖和遷移，抑制炎癥細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達[9]，發揮重要的抗炎作用。而CB2受體的激活能否對百草枯致大鼠急性肺損傷能否產生保護作用，國內文獻未見報道。本研究將采用CB2受體激動劑JWH133對百草枯中毒大鼠進行預處理，研究分析對肺損傷的保護作用以及對轉錄因子NF-κB 和AP-1的影響。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

百草枯(Sigma)；JWH133(Enzo Life Sciences)；TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(R&D)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物公司)；NF-κB p65和β-actin抗體(Abcam)；c-Fos和c-Jun抗體(Santa Cruz)；動脈血氣分析儀(ABL)；其余均為進口或國產分析純化學試劑。

2 動物與分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200～250 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。適應性喂養1周，大鼠飼養的溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在40%～70%，晝夜節律控制為12 h，自由進食水。該實驗方案經過中國醫科大學動物倫理委員會批準。

將72只大鼠隨機平均分成4組：百草枯中毒組(PQ組)：按照20 mg/kg劑量腹腔注射；低劑量JWH133預處理組(LJWH133組)在給予PQ腹腔注射前1 h腹腔注射5 mg/kg JWH133；高劑量JWH133預處理組(HJWH133組)在給予PQ腹腔注射前1 h腹腔注射20 mg/kg JWH133；對照組(control組)：1 mL生理鹽水腹腔注射。在相同條件下常規飼料飼養，自由取食和飲水，房間溫度(25±5)℃、濕度(50±10)%，人工照明，明暗各12 h。

3 主要方法

3.1 標本的采集及保存 在腹腔注射后8 h、1 d和3 d時，每組取出6只大鼠，使用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉。待麻醉充分后，將大鼠仰臥于鼠臺上固定，常規消毒后，切除皮膚，并逐層暴露股動脈鞘，完全游離股動脈約1 cm，將1 mL注射器以1%的肝素鈉潤管后，向股動脈近心端穿刺采血1 mL，以備血氣分析使用。打開大鼠胸腔暴露出肺臟，結扎右側肺門。血管夾夾閉右主支氣管，將頂端圓鈍的特制針頭插入氣管，用4 mL生理鹽水行肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液，重復3次。將標本計量后，4 ℃離心(1 000×g)10 min，分離并收集上清液置于-80 ℃保存。取肺左葉部分置于-80 ℃保存以備檢測，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。

3.2 動脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen, PaO2)的測定 將動脈血標本約1 mL放入動脈血氣分析儀中，測定動脈血氧分壓。

3.3 支氣管肺泡灌洗液IL-1β和TNF-α含量的測定 將收集的大鼠支氣管肺泡灌洗液，使用ELISA方法嚴格按照說明書檢測血清中IL-1β 和TNF-α含量。

3.4 肺組織損傷評分 將固定好的大鼠肺組織切割組織塊，至厚度約0.5 cm左右，常規組織梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋后連續切片，行HE 染色。光鏡下觀察肺組織病理學變化，并按Mikawa等[10]方法進行肺損傷評分。評分標準如下：對肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4項指標，分別依病變輕重評0～4分(0：無病變或非常輕微；1：輕度病變；2：中度病變；3：重度病變；4：極重度病變)。各項評定分數相加為肺損傷總評分。

3.5 Western blotting 法檢測肺組織NF-κB和AP-1的表達 按照細胞核蛋白提取試劑盒說明，提取肺組織核蛋白，進行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取20 μL 加樣；使用10% 聚丙烯酰胺凝膠在150 V、30 mA條件下電泳1.5 h；50 V 條件下PVDF 膜轉膜2 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加NF-κB p65Ⅰ抗(1∶50)和c-Fos、c-JunⅠ抗(1∶50)，4 ℃過夜; 用含0.1% Tween 20 的TBS 沖洗5 min 3次，再加入Ⅱ抗(1∶500)室溫下孵育2 h，用0.1% TBST 沖洗15 min 3 次，ECL 發光檢測，X 線片顯影，掃描圖像，測得各條帶的灰度值，以β-actin為內參照標準后，比較其表達量的變化。

4 統計學處理

采用SPSS 16.0 統計軟件進行分析，所有數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠PaO2的變化

正常對照組大鼠PaO2在90 mmHg以上，百草枯中毒以后PaO2明顯下降，中毒3 d時比較顯著；當使用CB2受體激動劑JWH133預處理以后，尤其是高劑量組(20 mg/kg)，隨時間的延長PaO2下降的程度有所緩和，在中毒1 d 和3 d時，與百草枯中毒組比較具有顯著差異(P< 0.05)，見圖1。

Figure 1.PaO2levels of rats in different groups at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPQ group.

圖1 不同組別大鼠在不同時點動脈血氧分壓的變化

2 支氣管肺泡灌洗液IL-1β和TNF-α含量測定

百草枯中毒組隨著中毒時間的延長，支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量明顯增加；當使用CB2激動劑JWH133預處理后二者表達量明顯下降，在百草枯中毒1 d 和3 d，與百草枯中毒組比較有顯著差異(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The levels of IL-1β (A)and TNF-α (B)in BALF of the rats in different groups at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPQ group.

圖2 不同組別大鼠在不同時點支氣管肺泡灌洗液IL-1β和TNF-α含量的變化

3 肺組織損傷評分

光鏡下所見正常肺組織肺泡結構完整，間質清晰，無炎性滲出，而百草枯中毒組3 d 時大鼠肺組織損傷嚴重，顯微鏡下可見肺泡結構破壞，肺間質水腫，大量炎性細胞浸潤。百草枯中毒組肺組織損傷評分較正常組比較明顯增加，而 JWH133預處理組的肺損傷程度明顯減輕，損傷評分下降，與百草枯中毒組比較有顯著差異(P<0.05)，見圖3。

4 NF-κB p65和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在肺組織中的量化分析

Western blotting 結果提示NF-κB p65和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在百草枯中毒組中表達較正常組明顯增加，而JWH133預處理組二者表達明顯下降，高劑量JWH133組更為顯著，與百草枯中毒組相比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、5。

討 論

百草枯中毒后，主要造成急性肺損傷，而且發展迅速。目前其機制并不是很清楚，除了本身可以造成氧化還原反應，炎性細胞因子的參與也起到非常重要的作用。百草枯中毒后產生大量活性氧自由基等除了直接的細胞毒性外，還通過激活炎性細胞，增加花生四烯酸代謝產物的產生，增加肺組織中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2和MMP-9的表達[11]，刺激炎癥細胞因子如TNF-α和IL-1β分泌，參與炎癥反應[12]。在組織病理學上可表現為肺泡結構破壞、肺間質水腫以及炎癥細胞浸潤。

Figure 3.HE staining of rat lung tissue (×200) and the lung injury scores in different groups at 3 d after PQ poisoning. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPQ group.

圖3 不同組別大鼠肺組織HE染色及肺組織的損傷評分

Figure 4.The protein expression of NF-κB p65 in different groups at 3 d after PQ poisoning. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPQ group.

圖4 不同組別大鼠肺組織NF-κB p65蛋白在百草枯中毒3 d的表達

Figure 5.The protein expression of c-Fos and c-Jun in different groups at 3 d after PQ poisoning. Mean±SD.n=6.*P< 0.05vsPQ group.

圖5 不同組別大鼠肺組織c-Fos和c-Jun蛋白在百草枯中毒3 d的表達

NF-κB是由Rel/NF-κB家族的多肽成員組成的一組轉錄因子，被稱為是免疫炎癥反應的中樞調節者[13]。在細胞靜息狀態下，Rel/NF-κB轉錄復合物以無活性的狀態存在于細胞漿中，當細胞暴露于各種細菌、病毒以及其代謝產物時，或者在缺血/再灌注、出血及休克等應激狀態下，NF-κB便可以被激活，進入細胞核內，啟動和調控多種與炎癥反應有關的細胞因子(IL-1β、TNF-α等)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素等)和趨化因子(IL-8等)的基因表達。AP-1是由 c-Fos 和 c-Jun 蛋白組成的同源或異源二聚體。靜息狀態下，AP-1 的蛋白濃度和活性極低，當細胞受到刺激時，c-Jun和c-Fos 表達水平增高，參與調控炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL- 8的表達，影響炎癥反應持續和發展[14]。TNF-α 是導致細胞或組織損傷的主要細胞因子，在局部或全身損傷后幾分鐘內由巨噬細胞釋放，然后直接作用于細胞并造成損傷；作用于中性粒細胞時，生成自由基，釋放各種蛋白酶和水解酶，誘導細胞凋亡[15]。IL-1β對巨噬細胞及中性粒細胞有趨化和黏附作用，增強血管通透性，能夠誘導IL-6合成[16]。

我們研究結果提示在百草枯中毒導致急性肺損傷的過程中，大鼠動脈血氧分壓隨著時間延長明顯降低，顯微鏡下所見大鼠肺泡組織結構破壞，肺間質水腫，中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞數量增加，肺組織中NF-κB和AP-1蛋白的表達增加，下游炎性細胞因子如IL-1β和TNF-α的表達不斷增加。分析升高的原因可能有兩方面原因：一是百草枯中毒后產生的大量氧自由基，導致其NF-κB和AP-1的激活；另一方面細胞因子如TNF-α、IL-1β等的大量釋放，也進一步參與兩者的活化。

CB2受體作為內源性大麻素系統重要組成部分之一，主要在包括B細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等免疫細胞中表達[17-18]。CB2受體被激活以后可通過抑制細胞內cAMP生成來發揮作用，減少T淋巴細胞的增殖，降低巨噬細胞生物活性和功能，明顯抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所誘發的炎性細胞因子TNF-α和 IL-1β的表達，抑制炎癥反應[19]。有研究報道在LPS誘導的葡萄膜炎實驗研究中，使用CB2受體激動劑HU308可以降低轉錄因子NF-κB和AP-1表達，減少致炎因子TNF-α、 IL-1β、 IL-6、 CCL5和CXCL2表達[20]。與該研究結果類似，我們研究發現百草枯中毒致大鼠急性肺損傷模型中，使用CB2受體激動劑JWH133進行預處理以后，肺組織損傷程度較百草枯中毒組有所緩解，動脈氧分壓較中毒組有一定程度的提高，肺泡灌洗液中的炎性細胞因子TNF-α和 IL-1β濃度均有不同程度減少，肺組織中NF-κB和AP-1蛋白表達含量明顯下降，尤其是高劑量組JWH133組更為明顯。分析認為JWH133激活肺組織中免疫細胞CB2受體，抑制免疫細胞活性和功能，進而抑制炎癥調控因子NF-κB和AP-1，減少下游TNF-α和 IL-1β等細胞因子的表達，減輕百草枯所導致的肺部炎癥反應，具體生物學機制需要進一步研究探討。

綜上所述，JWH133作為CB2受體激動劑，可以激活CB2受體，抑制NF-κB和AP-1蛋白的表達，抑制炎癥反應，緩解百草枯中毒所導致的大鼠急性肺損傷。CB2受體可以作為研究和治療百草枯中毒的新靶點。

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CB2 receptor agonist JWH133 exerts protective effects on rat model of paraquat-induced acute lung injury

LIU Zhen-ning, HAN Jun, ZHENG Qiang, ZHAO Min

(DepartmentofEmergencyMedicine,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China.E-mail:wfzd999@126.com)

AIM: To study the protective effects of cannabinoid CB2 receptor agonist JWH133 on rat acute lung injury induced by paraquat (PQ).METHODS: Male Sprague-Dawley rats (n=72) were randomly divided into 4 groups. PQ group: PQ was administered intraperitoneally at the dose of 20 mg/kg; Low-dose JWH133 pretreatment group (L-JWH133 group): JWH133 (5 mg/kg, ip) was administered 1 h before PQ exposure; high-dose JWH133 pretreatment group (H-JWH133 group): JWH133 (20 mg/kg, ip) was administered 1 h before PQ exposure; control group: 1 mL saline was administered intraperitoneally. Arterial blood, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue samples were collected at 8 h, 1 d and 3 d after PQ exposure. PaO2and the levels of TNF-α and IL-1β in BALF were measured via blood gas analyzer and ELISA, respectively. The pathological changes and lung injury scores were assessed at 3 d after PQ exposure. NF-κB and AP-1 protein levels were also determined by Western blotting.RESULTS: The decrease in PaO2, structural injury of the lung tissues, interstitial pulmonary edema, and the increase in IL-1β and TNF-α in BALF were observed in PQ-treated rats compared with control group. JWH133 pretreatment reduced the degree of lung tissue injury, decreased the levels of IL-1β and TNF-α in BALF and the NF-κB and AP-1 protein expression in the lung tissue compared with PQ group, especially in H-JWH133 group. CONCLUSION: CB2 receptor agonist JWH133 inhibits NF-κB and AP-1 protein expression in the lung tissues, and reduces the secretion of IL-1β and TNF-α in BALF after paraquat exposure, thus attenuating paraquat-induced acute lung injury.

Paraquat; Acute lung injury; Cannaboid CB2 receptor; Nuclear factor-κB; Activator protein-1

1000- 4718(2014)12- 2179- 06

2014- 07- 21

2014- 09- 13

國家自然科學基金資助項目(No. 81171793/H1503)； 遼寧省科學計劃項目(No.201102278)；遼寧省教育廳高等學校科學研究一般項目(No. L2014300)

R392.32

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.011

△通訊作者 Tel: 024-96615-64131； E-mail: wfzd999@126.com