弗林蛋白酶抑制劑對乳腺癌細胞MCF-7遷移的影響*

任京力， 史 齊 ， 孫明振， 宋國華， 馬永超

(漯河醫學高等專科學校 1醫學生物工程重點實驗室， 2藥學系藥理學教研室， 4生物化學教研室，河南 漯河 462000；3新鄉醫學院病理教研室，河南 新鄉 453000)

弗林蛋白酶抑制劑對乳腺癌細胞MCF-7遷移的影響*

任京力1, 2△， 史 齊3， 孫明振2， 宋國華1， 馬永超4

(漯河醫學高等專科學校1醫學生物工程重點實驗室，2藥學系藥理學教研室，4生物化學教研室，河南 漯河 462000；3新鄉醫學院病理教研室，河南 新鄉 453000)

目的： 探討乳腺癌轉移的機制，為深入研究乳腺癌發生、發展機制提供理論基礎。方法: 不同濃度的弗林蛋白酶(furin)抑制劑處理人乳腺癌細胞MCF-7 48 h。細胞劃痕實驗(wound healing assay)和細胞趨化實驗(Transwell assay)檢測MCF-7細胞遷移和侵襲能力。Western blotting 檢測細胞遷移相關蛋白膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)、血管內皮生長因子(VEGF)-C和VEGF-D水平。酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞培養液中基質金屬蛋白酶(MMP)2和9水平。結果: 與對照組相比，200 nmol/L的furin抑制劑α1-PDX即對細胞遷移及侵襲起顯著抑制作用(均P<0.05)；細胞遷移相關的MT1-MMP、VEGF-C和VEGF-D表達水平均顯著降低(P<0.05)；MCF-7細胞上清液中MMP2 和 MMP9的表達均顯著降低(P<0.05)。結論: Furin抑制劑通過下調乳腺癌細胞MCF-7的MMPs及VEGFs表達抑制其遷移。

弗林蛋白酶抑制劑； 乳腺腫瘤； 基質金屬蛋白酶； 血管內皮生長因子

前蛋白轉化酶家族的生物學及其與疾病的關系一直受到廣泛關注。弗林蛋白酶(furin)是蛋白前體加工酶家族中的重要成員，其與腫瘤細胞生物學特性的關系是腫瘤研究的重要領域。Furin在細胞定位于反面高爾基體囊膜、內體和細胞表面。細胞內許多重要的多肽與蛋白質激素的合成與分泌、膜受體的成熟、血漿蛋白前體的激活等過程需要furin的參與，這些蛋白質在發揮活性之前需要經過蛋白轉化酶對蛋白前體切割，然后才能成為有功能的蛋白質[1]。包括Notch、Wnt、膜型基質金屬蛋白酶1(membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在內的許多與腫瘤發生發展密切相關的蛋白質在體內成熟過程中，必須經過furin等蛋白轉化酶對其前體進行剪切，才能發揮生物學活性[2-3]。這些蛋白質中部分成員與腫瘤的發生、發展密切相關。因此furin酶活性及其對底物剪切的調控應該是腫瘤防治靶點。然而，綜合目前的研究，發現在不同的腫瘤，抑制furin的活性對腫瘤生物學行為的改變是不同的[4-5]。有關furin與乳腺癌轉移的關系目前還不清楚，我們當前的研究為揭示furin在乳腺癌發生發展中的作用提供了理論依據。

材 料 和 方 法

1 細胞與試劑

人乳腺癌細胞系MCF-7購自中國醫學科學院協和細胞庫，生長在含有10%胎牛血清(FBS)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基(Gibco)中，于37 ℃、 5% CO2飽和濕度下培養。Furin抑制劑α1-PDX(Merck)溶于DMSO中，制成5 mmol/L母液。鼠抗人VEGF-C、VEGF-D、MT1-MMP和GAPDH抗體均購自Santa Cruz；抗鼠IgG-HRP和抗兔IgG-HRP購自Sigma；MTT、Hoechst 33342和Transwell試劑購自Promega；基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2和MMP9 ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物試劑公司；其它試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 單層細胞遷移實驗(wound healing assay) MCF-7細胞接種在6孔板，待生長至融合度達100% 時，用無菌的200 μL的槍頭尖制成劃痕(wound)，并用PBS洗滌細胞碎片。細胞處理同前。在指定的時間用倒置顯微鏡配備的數碼相機拍攝受傷區域的細胞遷移情況。

2.2 Transwell侵襲實驗 不同濃度α1-PDX處理的MCF-7細胞(1×105)接種于Transwell小室的上部腔室，含有200 μL的RPMI-1640培養基，但不含10% FBS。Transwell小室下部腔室被填充有500 μL的完整的RPMI-1640培養基，含10%FBS。使細胞遷移48 h，然后用4%甲醛將細胞固定，室溫下孵育15 min。去離子水洗滌后，0.1%結晶紫染色。在光學顯微鏡下拍攝遷移的克隆。

2.3 Western blotting 檢測細胞遷移相關蛋白表達水平 MCF-7細胞培養及處理同前。收集細胞加入RIPA緩沖液及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30 min，13 200 r/min離心30 min。收集上清并用BCA法(Pierce)測定蛋白濃度。細胞總蛋白經12%的SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h。在4 ℃下孵育MT1-MMP、VEGF-C、VEGF-D和GAPDH(1∶1 000)的抗體過夜。PBST洗滌后加入HRP標記的羊抗鼠Ⅱ抗，室溫下孵育1 h， PBST洗滌后，超敏發光液(Pierce)孵育后，LAS3000成像儀拍照。

2.4 ELISA MCF-7細胞處理同前所述，收集細胞培養上清并根據MMP2和MMP9 ELISA檢測試劑盒說明書進行后續檢測。每個樣品重復5次。

3 統計學處理

應用SPSS 13.0 軟件進行統計學處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 α1-PDX對MCF-7細胞遷移和侵襲的影響

為檢測α1-PDX是否對MCF-7細胞的遷移和侵襲有調節作用，我們用wound healing和Transwell實驗檢測了MCF-7細胞遷移的情況。2種實驗結果均表明α1-PDX顯著降低了MCF-7細胞遷移和侵襲能力，見圖1、2。

Figure 1.The effects of α1-PDX on the migration of MCF-7 cells. A: original imaging of wounding healing assay upon stimuli of different concentrations of α1-PDX at different time points (×100); B: statistical analysis of the effects of α1-PDX on the migration of MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h.

圖1 α1-PDX對MCF-7細胞遷移的影響

Figure 2.The effects of α1-PDX on the invasion ability of MCF-7 cells (crystal violet staining，×100). A: control group; B: MCF-7 cells treated with 200 nmol/L α1-PDX for 48 h; C: MCF-7 cells treated with 400 nmol/L α1-PDX for 48 h； D: statistical analysis of the effects of α1-PDX on the invasion ability of MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol.

圖2 不同濃度α1-PDX對MCF-7細胞侵襲能力的影響

2 α1-PDX對細胞遷移相關蛋白表達的影響

許多蛋白質在體內參與腫瘤細胞遷移的調節。為充分了解α1-PDX調節MCF-7細胞遷移的分子機制，我們通過Western blotting和ELISA法檢測了細胞MT1-MMP、MMP2、MMP9、VEGF-C和VEGF-D蛋白表達水平。如圖3所示，α1-PDX顯著降低了細胞內MT1-MMP、VEGF-C和VEGF-D的表達。同時細胞培養液上清中MMP2和MMP9濃度也明顯低于對照組，見圖4。這些結果表明，α1-PDX抑制MCF-7細胞遷移可能與降低MT1-MMP、MMP2、MMP9、VEGF-C和 VEGF-D的表達有關。

Figure 3.The effects of α1-PDX on the expression of cell migration-associated proteins MT1-MMP, VEGF-C and VEGF-D. A: original Western blotting showing the protein expression of MT1-MMP, VEGF-C and VEGF-D upon treatment with different concentrations of α1-PDX for 48 h; B: statistical analysis of the protein expression levels of MT1-MMP, VEGF-C and VEGF-D upon treatment with different concentrations of α1-PDX for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol.

圖3 α1-PDX對遷移相關蛋白MT1-MMP、 VEGF-C及VEGF-D表達的影響

Figure 4.The effects of α1-PDX on the protein levels of MMP9 (A) and MMP2 (B) in the supernatant of MCF-7 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

圖4 α1-PDX對MCF-7細胞上清液中MMP9和MMP2水平的影響

討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌而位居第二，我國雖是乳腺癌低發區，但其發病率也正逐年上升[5]，在大城市中已經接近歐美國家的發病水平，故對乳腺癌的研究越來越受到重視。晚期乳腺癌患者中，最常見的并發癥為骨、肺和肝等轉移。隨著對乳腺癌生物學行為研究的不斷深入，目前認為乳腺癌發病就是全身性疾病，其主要的死亡原因是遠處轉移，最常見的遠處轉移部位是骨骼[6]。因而進行深入研究乳腺癌侵襲和轉移的分子機制很有必要。

Furin在腫瘤進展中發揮重要作用，可以作為腫瘤進展過程中的分子標記，在某種程度上可以作為腫瘤預后的指標[7]。許多與腫瘤密切相關的蛋白成熟需經過furin蛋白的剪切加工。所以，furin活性及其與底物蛋白相互作用的調節可以作為腫瘤治療的靶點。抑制furin活性對抑制腫瘤的遷移和侵襲有積極作用。弗林蛋白酶抑制劑α1-PDX為目前常用的furin抑制劑。α1-PDX為一生物工程重組的α1-蛋白酶突變體，其特殊之處是在其活性位點環中有一段單一最小弗林蛋白酶共享序列(Arg355-Ile-Pro-Arg358)，起到抑制furin活性的作用。

在本研究中，我們發現，furin抑制劑α1-PDX可誘導MCF-7細胞增殖抑制和凋亡。此外，我們還發現， MCF-7細胞經α1-PDX孵育后，遷移能力顯著降低。但具體的分子機制不清楚。腫瘤轉移是一個復雜的多步驟的過程。許多蛋白分子參與腫瘤轉移的過程。眾所周知，腫瘤細胞外基質消化是腫瘤最常見的侵襲和轉移的前提條件，腫瘤細胞分泌的MMPs可以降解所有的細胞外基質的重要組成部分[8-9]。因此，這些基質金屬蛋白酶的表達水平可有效反映腫瘤細胞的侵襲能力。已經證明在許多類型的腫瘤中基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9降解基底膜是促進腫瘤侵襲和轉移關鍵的步驟[10]。MT1-MMP參與激活MMP2和MMP13，降解細胞周圍基質[11]。

在我們當前的研究中，α1-PDX不僅能抑制MMP2和MMP9的表達，而且能降低MT1-MMP的表達。由于MT1-MMP是furin的底物，MT1-MMP在成熟前需要furin對前體進行剪切[1]。α1-PDX降低了furin酶活性，進而降低了MT1-MMP 成熟及激活，進一步抑制了MMP2和MMP9的成熟。

VEGF調節腫瘤的轉移和血管生成[12]。VEGF-C和VEGF-D的表達增強可促進腫瘤細胞淋巴轉移，已經被認為是幾種類型癌癥的一個預后指標[12]。VEGF-C和VEGF-D 的成熟、激活需要furin對其前體進行剪切[1]。所以，我們同時檢測了α1-PDX處理后細胞VEGF-C和VEGF-D的表達。結果表明α1-PDX處理的細胞VEGF-C和VEGF-D蛋白表達顯著減少。

總之，這些結果表明，下調furin的活性，從而抑制MCF-7細胞MMPs和VEGFs蛋白的表達可能是其抑制MCF-7細胞生長、侵襲的機制。Furin抑制劑對其它腫瘤細胞遷移抑制作用的研究已經引起人們的重視[13-14]。但在不同的腫瘤細胞系中的作用是不一樣的，甚至是相反的[4-5]，因此，furin抑制劑在腫瘤中的作用研究僅僅是個開始，還有很多的未知機制需要深入研究。

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Effects of furin inhibitor on metastasis of human breast cancer MCF-7 cells

REN Jing-li1, 2, SHI Qi3, SUN Ming-zhen2, SONG Guo-hua1, MA Yong-chao4

(1KeyLaboratoryofMedicalBioengineering，2DepartmentofPharmacology，FacultyofPharmacy，4DepartmentofBiochemistry,LuoheMedicalcollege，Luohe462000,China;3DepartmentofPathology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453000,China.E-mail:renjimmy@sina.com)

AIM: To investigate the mechanism underlying breast cancer metastasis and to provide theoretical data for studying the pathogenesis of breast cancer onset and development. METHODS: Human breast cancer MCF-7 cells were treated with different concentrations of furin inhibitor α1-PDX for 48 h. Wound healing assay and Transwell assay were applied to detect the migration and invasion abilities of the MCF-7 cells. The expression of cell migration-associated proteins, including membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP), vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D， was determined by Western blotting. The protein levels of MMP2 and MMP9 in the supernatant were measured by ELISA. RESULTS: Compared with control group, 200 nmol/L of furin inhibitor exerted significant inhibitory effects on the cell migration (P<0.05). The expression of cell migration-associated proteins MT1-MMP, VEGF-C and VEGF-D was significantly inhibited after treated with α1-PDX (P<0.05). Significant inhibitory effects of α1-PDX on the expression of MMP9 and MMP2 (P<0.05) in the supernatant were observed. CONCLUSION: Furin inhibitor suppresses the metastasis of MCF-7 cells via down-regulating the expression of MMPs and VEGFs.

Furin inhibitors; Breast neoplasms; Matrix metalloproteinases; Vascular endothelial growth factors

1000- 4718(2014)12- 2267- 05

2014- 07- 17

2014- 09- 04

河南省高校科技創新人才支持計劃資助項目(No. 2012HASTIT038)

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.027

△通訊作者 Tel: 0395-3115098； E-mail: renjimmy@sina.com