1α, 25-二羥維生素D3對早期角膜移植小鼠Th17細胞的免疫調控作用*

吳 靜， 張 瑾， 侯光輝， 崔裕波， 王 超， 陳 劍

(暨南大學 1醫學院眼科研究所， 2附屬第一醫院眼科，廣東 廣州 510632；3珠海市人民醫院眼科，廣東 珠海 519000)

1α, 25-二羥維生素D3對早期角膜移植小鼠Th17細胞的免疫調控作用*

吳 靜1△， 張 瑾2， 侯光輝3， 崔裕波2， 王 超2， 陳 劍2

(暨南大學1醫學院眼科研究所，2附屬第一醫院眼科，廣東 廣州 510632；3珠海市人民醫院眼科，廣東 珠海 519000)

目的： 觀察在同種異體角膜移植的小鼠模型中，1α, 25-二羥維生素D3對Th17細胞及其相關細胞因子的影響。方法: C57BL/6 小鼠作為受體，BALB/c小鼠作為供體，建立小鼠穿透性角膜移植術模型。術后隔日對角膜移植小鼠腹腔注射1.0 μg 1α，25二羥維生素D3(維生素D3干預組)，模型組和正常對照組腹腔注射等量大豆油。在裂隙燈活組織鏡下觀察角膜移植物的透明情況，評估排斥反應的發生情況，并取角膜移植物做病理學檢測。采用實時熒光定量PCR檢測脾臟中IL-17、RORγt和IFN-γ的表達水平，Western blotting分析外周血中RORγt及IL-17的蛋白含量，流式細胞術檢測外周血IL-17和IFN-γ細胞因子的表達情況。結果: 1α, 25-二羥維生素D3顯著地抑制了同種異體角膜移植排斥反應，同時減少了角膜移植物的炎性滲出。應用1α, 25-二羥維生素D3治療后，小鼠脾臟中IL-17、RORγt和IFN-γ的表達水平降低；外周血中IL-17、RORγt和IFN-γ的表達水平被下調。結論: 1α, 25-二羥維生素D3抑制小鼠同種異體角膜排斥反應的作用與IL-17及相關細胞因子RORγt細胞調節密切相關。

1α, 25-二羥維生素D3； 角膜移植術； 輔助性T細胞17； 白細胞介素17； 維甲酸相關孤兒受體γt

角膜病是最常見的致盲性眼病之一，角膜移植術是重建視力最主要的手段，在所有器官移植手術中成功率最高，因為角膜有自己獨特的結構，缺乏血管和淋巴管，稱為“免疫特權”[1]。盡管有這個“特權”，還是可以通過很多因素刺激角膜新生血管的增加和炎癥細胞的浸潤，引起角膜移植免疫排斥反應，導致再次致盲。當前角膜免疫排斥反應發生機制與多種細胞因子、炎癥介質共刺激信號和信號轉導通路有關。輔助T細胞17(T helper cell 17，Th17)是近幾年發現的CD4+T細胞新亞群，與Th1細胞之間具有密切聯系，通過產生促炎癥細胞因子IL-17和IFN-γ等，誘發急、慢性炎癥和組織損害[2-3]，調節器官移植排斥反應的發生發展[4]。

為降低角膜移植術后排斥反應，目前臨床上長期應用的傳統免疫抑制劑有一定的局限性和毒副作用。如何低毒高效地降低角膜移植排斥反應，一直以來都受到研究者關注。 1α, 25-二羥維生素D3(1α, 25-dihydroxyvitamin D3)是維生素D3的活性形式。近年來認為其不僅具有調節鈣磷代謝的作用，還可以通過維生素D受體作用于大多數免疫細胞，起著抗炎、下調MHCⅡ類分子和共刺激信號分子、促進外周T 淋巴細胞凋亡的作用[5-6]。我們設想通過建立小鼠穿透性角膜移植模型，以Th17細胞亞群為突破點，研究探討1α, 25-二羥維生素D3干預角膜移植排斥反應的免疫機制，為低毒性控制角膜移植術后免疫排斥反應提供新思路。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與材料

健康SPF級雌性C57BL/6小鼠(n=30)作為受體，健康SPF級雌性BALB/c小鼠(n=10)作為供體，體重約(20±3)g，鼠齡6周，由廣州省動物實驗中心提供，動物許可證號為SCXK(粵)2008-0002。

將規格為每粒0.25 μg的1α,25-二羥維生素D3(Roche)液體稀釋于無菌大豆油中，配成濃度為1 mg/L的腹腔注射液制品。兔抗小鼠RORγt抗體和兔抗小鼠IL-17抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；抗β-actin抗體購自Santa Cruz；Trizol試劑購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購于日本東洋紡公司；引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；熒光素標記抗小鼠單克隆抗體包括anti-IL-17-FITC、anti-IFN-γ-APC及同型對照購自BD。

JS-Power300電泳儀(上海培清)；臺式冷凍高速離心機(Eppendorf)；眼科手術顯微鏡(蘇州六六六視覺股份有限公司)；微型PCR儀(BD)；凝膠成像系統和流式細胞儀(BD)。

2 方法

2.1 穿透性角膜移植模型的建立和分組 動物適應性喂養1周后，從C57BL/6小鼠中隨機抽取10只為正常對照組，其余小鼠行穿透性角膜移植術(penetrating keratoplasty，PKP)。以雌性BALB/c小鼠作為角膜供體，取雙眼角膜后處死，雌性C57BL/6小鼠作為受體，術前用復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，腹腔注入水合氯醛3 mL/kg全身麻醉，用環鉆獲取供體中央全層植片，置于受體角膜植床上，用11-0縫線行間斷縫合6針，術后向前房內注入無菌空氣。術畢，給移植眼結膜囊內涂左氧氟沙星凝膠。若出現明顯的并發癥及死亡，則進行補充，將建模成功的小鼠分為角膜移植組(PKP組，n=10)和VitD3干預組(PKP+ VitD3組，n=10)。術后1周內均用左氧氟沙星滴眼液點術眼，每天3次，術后對PKP+ VitD3組小鼠隔日腹腔注射1α, 25-二羥維生素D31.0 μg·kg-1·d-1，對照組(control)和PKP組小鼠隔日腹腔注射同等劑量的大豆油，連續2 周。

2.2 術后臨床觀察 術后每天在裂隙燈下觀察角膜植片的透明程度，有無水腫及其程度，有無新生血管生成、數量和伸入達到植片象限范圍的情況。

2.3 標本收集 于術后14 d隨機處死每組小鼠，經心臟取其外周血、完整角膜和脾臟用于實驗檢測。

2.4 角膜病理學檢查 將小鼠完整角膜(連角膜緣)置于4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，制成4 μm 石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察組織結構變化。

2.5 Real-time PCR檢測RORγt、IL-17和IFN-γmRNA表達水平 取各組小鼠脾臟加入小鼠淋巴分離液充分研磨、離心，提取淋巴細胞，用Trizol法提取RNA，紫外分光光度儀測定A260/A280值并計算RNA濃度。取總RNA 1 μL合成產物cDNA。以此cDNA 1 μL為模版進行real-time PCR，反應體系20 μL，引物序列見表1。按下列條件進行擴增：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法比較樣本中靶基因的相對表達量。

2.6 Western blotting檢測RORγt和IL-17的蛋白表達水平 取各組小鼠的外周血約2 mL，加入小鼠淋巴細胞分離液，離心后獲得淋巴細胞。按比例加入裂解液，根據BCA蛋白定量試劑盒進行定量測定蛋白濃度，取總蛋白30 μL，SDS-PAGE分離目的蛋白，轉膜，將膜浸在封閉液中37 ℃封閉1 h，再加入I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；PBST洗膜5 min 4次；將膜轉入II抗(1∶30 000)中室溫孵育1 h，PBST洗膜5 min 5次；ECL增強顯色；凝膠圖像分析儀曝光拍照，實驗重復3次。采用ImageJ 軟件對目的蛋白條帶進行灰度掃描，以GAPDH作為內參照，結果以目的條帶灰度值/同個樣品GAPDH灰度值表示。

2.7 流式細胞術檢測細胞內細胞因子IL-17和IFN-γ的比例 將各組小鼠外周血2 mL肝素化處理并分裝于EP管中。每組樣本接種于6孔培養板，加入佛波酯(PMA)、離子霉素(inomycin)和布雷菲德菌素A(BFA)，在37 ℃、5% CO2條件下培養4 h，洗滌去上清；每管加anti-IL-17-FITC混勻，室溫避光放置40 min，洗滌后去上清；使用破膜劑重懸細胞，具體操作按照試劑盒說明進行。加anti-IFN-γ-APC混勻，室溫避光放置40 min，洗滌并重懸細胞，上機測定。采用FlowJo 7.3軟件分析細胞內因子IL-17和IFN-γ的比例。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 術后植片的觀察

PKP組的角膜植片明顯混濁，移植片邊緣有新生血管長入，角膜移植免疫排斥反應發生；PKP+VitD3組的角膜植片水腫及混濁程度較前減輕，新生血管回退，角膜免疫反應減輕。

2 組織病理學結果

術后14 d, PKP組的角膜明顯水腫增厚, 大量炎癥細胞浸潤，基質板層結構喪失，且有大量新生血管形成；PKP+VitD3組的角膜移植片水腫增厚程度較PKP組輕，少量炎癥細胞浸潤；正常對照組角膜無水腫，角膜各組織結構清晰有序，可見散在炎癥細胞浸潤，見圖1。

Figure 1.The pathological changes of cornea tissues in mice with different treatmens (HE staining,×400). A: control group; B: PKP group; C: PKP+VitD3group．

圖1 各組小鼠角膜組織病理變化

表1 引物序列

3 IL-17、RORγt和IFN-γ mRNA的表達水平

Real-time PCR檢測結果顯示與正常對照組比較，PKP組小鼠脾臟組織IL-17、IFN-γ及RORγt mRNA表達量均明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與PKP組比較，PKP+VitD3組的IL-17、IFN-γ及RORγt mRNA表達量均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠脾臟組織細胞因子的real-time PCR結果

Table 2.The effect of VitD3on the mRNA expression of IL-17, RORγt and IFN-γ (Mean±SD.n=10)

GroupIL-17RORγtIFN-γControl1.02±0.261.06±0.121.03±0.32PKP28.08±0.72*4.45±0.44*29.87±0.15*PKP+VitD36.93±0.54*#2.26±0.21*#3.51±0.18*#

TableP<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPKP group.

4 IL-17和RORγt的蛋白表達水平

Western blotting的檢測結果可見正常對照組的IL-17蛋白表達量明顯低于PKP組和PKP+VitD3組，而 PKP+VitD3組明顯低于PKP組，差異有統計學意義(P<0.05)。PKP組的RORγt蛋白表達高于正常對照組和PKP+VitD3組，而PKP+VitD3組略高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

5 外周血T淋巴細胞細胞因子IL-17及IFN-γ的表達水平

與正常對照組相比較，PKP組的IFN-γ表達顯著升高，IL-17升高但沒有IFN-γ顯著；PKP+VitD3組的細胞因子IFN-γ表達高于正常對照組，但低于PKP組；細胞因子IL-17的表達低于PKP組，差異有統計學意義(P<0.05)，而和正常對照組之間差異無明顯統計學意義，見圖3、表3。

Figure 2.The protein expression of IL-17 (A) and RORγt (B) detected by Western blotting. The GAPDH was used as internal control.Mean±SD.n=10.**P<0. 01vscontrol group;#P<0. 05vsPKP group.

圖2 Western blotting檢測IL-17 和 RORγt蛋白水平的變化

Figure 3.The expression of IL-17 and IFN-γ in T cells in peripheral blood detected by flow cytometry. A: control group; B: PKP group; C: PKP+VitD3group.

圖3 各組小鼠外周血T淋巴細胞中IL-17和IFN-γ的表達

討 論

移植術后的排斥反應是角膜移植失敗的主要原因，如何高效低度性控制角膜移植術后免疫排斥反應，提高角膜移植片的成活率以提高角膜盲的治愈率一直以來都倍受關注。眾所周知目前傳統抗排斥藥物由于大劑量長時間使用，可造成不可忽視的神經毒性、肝腎功能損傷及高血壓等毒副作用，并激發白內障和青光眼等并發癥。因此，眾多學者一直致力于高效低毒的免疫抑制物質的研發。

近年來, 1α, 25-二羥維生素D3除具有調節鈣磷代謝的作用外，研究者們注意到了它在免疫調節中的重要角色和降低炎癥反應的作用，并且作為一種新型的免疫調節劑被嘗試性地應用到多種免疫相關性疾病的治療研究中[7]。活性形式的維生素D3在炎癥性腸病中作用于T細胞，促進輔助性T細胞2和調節性T細胞應答，抑制樹突狀細胞炎癥活動，包括抗菌活性和調節促炎癥細胞因子的產生[5]。在器官移植中應用1α, 25-二羥維生素D3后，移植物中IL-2 和 IFN-γ水平減少，IL-10 增加，抑制了適應性T細胞介導的急性排斥反應，從而延長移植物的存活時間[8]。所以我們把1α, 25-二羥維生素D3應用于角膜移植排斥反應中，看看是否可以抑制角膜免疫排斥反應。此外Th17 細胞參與了免疫排斥反應及炎癥反應，但在角膜移植方面的研究相對較少，因此，我們想通過1α, 25-二羥維生素D3在角膜移植中對Th17細胞的影響，來驗證是否可以抑制角膜移植免疫排斥反應。從實驗結果中我們發現1α, 25-二羥維生素D3顯著地改善了角膜病理組織表現，角膜混濁、水腫和新生血管的發生明顯降低，減少了炎癥細胞的浸潤，維持角膜正常板層組織結構。同時1α, 25-二羥維生素D3可以降低Th17分泌的相關細胞因子，減輕了角膜移植免疫排斥反應。

表3 各組小鼠外周血T淋巴細胞內細胞因子IL-17和IFN-γ的表達

Table 3.The levels of intracellular IL-17and IFN-γ in T cells of the mice with different treatments (Mean±SD.n=10)

GroupIL-17IFN-γControl0.05±0.181.75±0.19PKP0.56±0.20*5.56±0.32*PKP+VitD30.14±0.11#2.83±0.53*#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPKP group.

角膜免疫排斥反應的發生機制與免疫炎癥反應的多種細胞因子、炎癥介質密切相關。CD4+T細胞是介導排斥反應最主要的細胞群體，其失調是許多慢性炎癥和自身免疫疾病發生的病理機制。Th17細胞是新近發現CD4+T細胞的一個細胞亞群，與自身免疫性疾病和移植免疫的發生密切相關，打破了以往Th1/Th2免疫調節模式。在角膜移植術后，Th17細胞通過分泌炎癥因子調節免疫反應，介導組織損傷[9]。研究進一步確定了Th17細胞及其分泌的IL-17、IL- 6、TGF- β和IL- 21等細胞因子能促進炎癥反應和器官移植免疫排斥反應[10]。IL-17是強有力的促炎癥細胞因子，導致趨化因子表達、白細胞浸潤和介導組織炎癥，從而在急性炎癥反應及移植免疫排斥反應中發揮重要作用[11]。IL-17的表達水平也與炎癥反應發生程度密切相關。我們觀察到，在角膜移植小鼠的血清及脾臟中IL-17的mRNA和蛋白表達量明顯增高，注射1α, 25-二羥維生素D3以后，與角膜移植組相比顯著減少，表明Th17細胞參與早期角膜免疫排斥反應；應用1α, 25-二羥維生素D3可以下調IL-17的蛋白翻譯水平及轉錄水平，從而抑制角膜免疫排斥反應。同時在角膜移植術后早期出現高水平表達的IFN-γ，提示Th1細胞也參與了角膜移植免疫排斥反應的發生，與Th17細胞共同促進排斥反應的發生。應用1α, 25-二羥維生素D3不僅可以減少Th17細胞分泌IL-17等促炎癥因子，也可以下調Th1細胞分泌的IFN-γ，表明1α, 25-二羥維生素D3對Th1細胞及Th17細胞均有抑制作用，比單一運用IL-17單克隆抗體抑制角膜排斥反應[12]的效果更好，對早期和后期角膜免疫排斥反應都有影響。

RORγt 是Th17細胞特征性轉錄因子，通過在分子水平調控T細胞和免疫器官的發育、成熟及細胞因子的產生，并誘導Th17細胞分泌IL-17，從而在T細胞分化調控中發揮關鍵作用[13]。RORγt不僅參與Th17細胞介導的器官移植急性排斥反應的發生，還可從調節IL-17分泌等方面促進排斥反應[14-15]。我們的研究結果顯示，RORγt的蛋白和mRNA表達量越高，角膜組織炎癥細胞浸潤數量就越多，RORγt的變化情況與IL-17的變化趨勢大致相同，從轉錄因子水平進一步佐證了Th17細胞與角膜移植排斥反應的嚴重程度相關。隨著RORγt表達被1α, 25-二羥維生素D3干預下降的同時，角膜免疫排斥反應的癥狀也減輕了，通過降低RORγt表達而抑制Th17分化，導致Th17細胞分泌促炎癥因子減少，這可能是1α, 25-二羥維生素D3參與抑制角膜免疫排斥反應發生的免疫機制。

總之，我們證實了1α, 25-二羥維生素D3對穿透性角膜移植模型小鼠體內的Th17細胞分化有潛在影響。Th17細胞在角膜移植免疫排斥反應中發揮了致病的作用，干擾Th17細胞的發生發展能影響小鼠角膜免疫排斥反應的發生。本研究提供了關于1α, 25-二羥維生素D3作為新型免疫抑制劑抑制角膜免疫排斥反應的新思路。然而，我們只證明了1α, 25-二羥維生素D3可以影響Th17的分化及其相關細胞因子的產生，從而減輕角膜免疫排斥反應發生，還需要更深層次地去探索其它基礎免疫機制。

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Effect of 1α, 25-dihydroxyvitamin D3on T helper cell 17 and expression of related cytokines in penetrating keratoplasty in mice

WU Jing1, ZHANG Jin2, HOU Guang-hui3, CUI Yu-bo2, WANG Chao2, CHEN Jian2

(1InstituteofOphthalmology,SchoolofMedicine,2DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3DepartmentofOphthalmology,ZhuhaiPeople’sHospital,Zhuhai519000,China.E-mail:twujing@jnu.edu.cn)

AIM: To evaluate the effects of 1α, 25-dihydroxyvitamin D3on T helper cell 17 (Th17 cells) and its related cytokines in a mouse model of corneal allograft transplantation. METHODS: C57BL/6 mice were transplanted with corneal grafts from BALB/c mice and treated intraperitoneally with 1.0 μg 1α, 25-dihydroxyvitamin D3or soybean oil every other day after operation. The transparency of the corneal grafts was evaluated for potential rejection signs by slit lamp biomicroscopy and histopathology. The expression levels of IL-17, RORγt and IFN-γ in the spleen were measured by real-time PCR. Moreover, the protein expression of RORγt and IL-17 in the peripheral blood was analyzed by Western blotting. IL-17 and IFN-γ in peripheral blood were measured by flow cytometry. RESULTS: 1α, 25-dihydroxyvitamin D3significantly inhibited the rejection of the corneal allograft and reduced the numbers of inflammatory infiltrates in the corneal graft. In the spleen, 1α, 25-dihydroxyvitamin D3treatment reduced the expression levels of IL-17, RORγt and IFN-γ. In the peripheral blood, 1α, 25-dihydroxyvitamin D3treatment downregulated the expression levels of RORγt, IL-17 and IFN-γ. CONCLUSION: The effects of 1α, 25-dihydroxyvitamin D3on suppressing corneal transplantation-induced allograft rejection in mice are closely associated with its modulation on IL-17 and related cytokine RORγt.

1α, 25-Dihydroxyvitamin D3; Keratoplasty; T helper cell 17; Interleukin-17; Retinoid-related orphan receptor γt

1000- 4718(2014)12- 2226- 06

2014- 07- 17

2014- 10- 11

珠海市重點科技項目(No. 2013D 0401990017)

R363； R77

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.019

△通訊作者 Tel: 020-85226413； E-mail: twujing@jnu.edu.cn